Analisis hasil sekuensing

12.1.4 Analisis hasil sekuensing

Hasil sekuensing dianalisis dengan menggunakan program Seqman (DNASTAR) untuk melihat ada/tidaknya mutasi yang terjadi (Yueniwati Y., 2012).

Hasil analisis pada basa nomor -2518 tidak menunjukkan adanya mutasi. Untuk semua sampel yang dianalisis tidak terjadi perubahan basa guanin, seperti dapat dilihat sebagai berikut (Yueniwati Y., 2012).

Bab 12 – Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Variasi Genetika

Sumber: Yueniwati Y., 2012 Gambar 12.7 Analisis mutasi basa no -2518 pada hasil sekuensing dengan

primer MCP-1 forward

Sumber: Yueniwati Y., 2012 Gambar 12.8 Analisis mutasi basa no -2518 pada hasil sekuensing dengan

primer MCP-1 reverse

Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Ultrasonografi ...

Mutasi terjadi pada basa nomor -2138 di mana terjadi substitusi basa adenin menjadi timin. Mutasi terjadi pada dua sampel yang merupakan sampel kontrol dan satu sampel yang merupakan sampel kasus. Berikut adalah hasil analisis mutasi pada basa no. -2138 pada hasil sekuensing yang menggunakan primer reverse dan forward. Sekuensing dari 2 arah tersebut menunjukkan terjadinya mutasi pada lokasi yang sama pada sampel yang sama pula (Yueniwati Y., 2012).

Sumber: Yueniwati Y., 2012

Gambar 12.9 Analisis mutasi basa no -2138 pada hasil sekuensing dengan primer MCP-1 forward

Bab 12 – Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Variasi Genetika

Sumber: Yueniwati Y., 2012 Gambar 12.10 Analisis mutasi basa no -2138 pada hasil sekuensing dengan

primer MCP-1 reverse

Mutasi selanjutnya terjadi pada basa nomor -2464 di mana terjadi mutasi basa guanin menjadi adenin. Mutasi terjadi pada satu sampel yang merupakan sampel kasus. Berikut adalah hasil pensejajaran untuk analisis mutasi pada basa nomor -2464 pada hasil sekuensing menggunakan primer forward maupun reverse (Yueniwati Y., 2012).

Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Ultrasonografi ...

Sumber: Yueniwati Y., 2012 Gambar 12.11 Analisis mutasi basa no -2464 pada hasil sekuensing dengan

primer MCP-1 forward

Sumber: Yueniwati Y., 2012 Gambar 12.12 Analisis mutasi basa no -2464 pada hasil sekuensing dengan

primer MCP-1 reverse

Bab 12 – Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Variasi Genetika

Hasil sekuensing yang mengalami polimorfisme tampak pada tabel berikut.

Tabel 12.1  Deskripsi hasil sekuensing Nama sampel

St7 Perubahan nukleotida

St23, Se5, Se21

G-2464 A Keterangan: Pada 20 anak (74%) dari 27 anak dengan orang tua stroke iskemia

A-2138 T

dan 14 anak (51,9%) dari 27 anak dengan orang tua sehat yang disekuensing, ditemukan 4 (11,8%) yang mengalami perbedaan

basa nukleotida. Sumber: Yueniwati Y., 2012

Seperti tercantum pada tabel 12.1, hasil sekuensing DNA menunjukkan adanya dua macam perbedaan basa nukleotida pada gen pengkode MCP-1. Perbedaan pertama adalah perubahan basa adenin menjadi timin pada basa ke -2138 (A-2138T), ditemukan pada 5% anak populasi Jawa dengan orang tua stroke iskemia dan 14,3% anak populasi Jawa dengan orang tua sehat. Perbedaan kedua adalah perubahan basa guanin menjadi adenin pada basa ke -2464 (G-2464A), ditemukan pada 5% anak populasi Jawa dengan orang tua stroke iskemia dan tidak ditemukan pada anak populasi Jawa dengan orang tua sehat. Kedua perbedaan basa nukleotida tersebut dapat dikatakan sebagai polimorfisme karena terjadi pada lebih dari 1% sampel yang mewakili populasi (Yueniwati Y., 2012). Telah diketahui bahwa polimorfisme adalah perubahan sekuen DNA yang terjadi pada lebih dari 1% populasi. Polimorfisme dibedakan dengan mutasi berdasar frekuensi kejadiannya. Mutasi adalah perubahan sekuen DNA yang terjadi pada kurang dari 1% populasi (Twyman, 2003). Temuan polimorfisme MCP-1 pada penelitian ini baru dan spesifik, berbeda secara signifikan dengan yang pernah dilaporkan sebelumnya (Yueniwati Y., 2012).

Polimorfisme MCP-1 yang ditemukan merupakan mutasi gen pada tingkat nukleotida yang disebut mutasi titik (point mutation), di mana hanya satu basa pada DNA yang mengalami perubahan. Mutasi pertama terjadi akibat perubahan basa adenin menjadi timin pada basa ke -2138, disebut transversi karena terjadi substitusi basa purin oleh pirimidin. Mutasi kedua terjadi akibat perubahan basa guanin menjadi adenin pada basa ke -2464,

Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Ultrasonografi ...

disebut transisi akibat substitusi basa purin (Yueniwati Y., 2012). Transisi jauh lebih sering terjadi daripada transversi, karena transversi membutuhkan modifikasi-modifikasi molekul DNA yang lebih besar (Granner and Weil, 2006).

Perubahan basa nukleotida tersebut terjadi karena ketidakstabilan basa nukleotida dalam DNA. Basa nukleotida dapat mengalami perubahan struktural yang disebut tautomeric shift. Perubahan tersebut menyebabkan penyebaran ulang elektron dan proton yang menyebabkan basa tidak dapat berpasangan secara normal. G mungkin berpasangan dengan T atau A dengan C. Perubahan sekuen nukleotida tersebut dapat diwariskan. Tipe variasi sekuen DNA yang paling sering dijumpai dalam genome manusia adalah SNP (single nucleotide polymorphism), yaitu apabila satu basa berbeda antar individu. SNP terjadi lebih kurang satu kali setiap 1000 pasangan basa dalam genom (Twyman, 2003). Pada genom manusia bisa terjadi 10 juta SNP. Akan tetapi, hanya ± 1% yang mungkin memiliki konsekuensi fungsional (Granner and Weil, 2006)

Baik basa -2138 maupun basa -2464 merupakan situs promoter yaitu situs pengontrol yang terletak di awal gen struktural, upstream dari start site MCP-1. Situs pengontrol adalah sekuen nukleotida pada DNA yang mengontrol ekspresi gen struktural yang terletak di sebelahnya. Promoter adalah bagian dari DNA yang memfasilitasi transkripsi partikular gen, Transkripsi suatu gen struktural hanya terjadi jika di dekat ujung gen tersebut ada promoter untuk pengikatan RNA polimerase. Sekuens pasangan basa promoter tersebut menentukan efisiensi pengikatan dengan RNA polimerase dan dengan demikian menentukan pula efisiensi transkripsi. Faktor transkripsi melekat pada situs pengikatan di daerah promoter dan merangsang RNA polimerase untuk berikatan dengan situs promoter. Promoter terletak berdekatan dengan DNA yang diregulasi, pada strand yang sama dan biasanya upstream. Polimorfisme pada situs promoter akan mempengaruhi aktivitas transkripsi dan ekspresi gen. Situs promoter tidak ikut pada proses translasi (Yueniwati Y., 2012).

Bab 12 – Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Variasi Genetika

Polimorfisme promoter MCP-1 A-2138T ditemukan pada anak populasi Jawa dengan orang tua stroke iskemia dan anak populasi Jawa dengan orang tua sehat. Polimorfisme ini belum pernah dilaporkan ditemukan pada orang sehat sehingga temuan penelitian ini merupakan temuan baru. Polimorfisme MCP-1 A-2138T pernah dilaporkan ditemukan pada penderita infark myocard di Jepang yang berusia lebih dari 65 tahun. Pada penelitian tersebut adanya polimorfisme MCP-1 A-2138T secara signifikan berhubungan dengan kadar serum MCP-1 dan kejadian infark myocard (Iwai et al., 2006).

Polimorfisme MCP-1 A-2138T pada penelitian ini ditemukan pada kelompok kasus dan kelompok kontrol. Deskripsi anak populasi Jawa dengan polimorfisme A-2138T pada penelitian ini adalah seperti yang dijelaskan berikut ini (Yueniwati Y., 2012).

1. Sampel anak penderita stroke iskemia yang mempunyai polimorfisme adalah anak laki-laki berusia 15 tahun dengan ayah penderita stroke iskemia. Serangan pertama saat ayah berusia 45 tahun dan serangan kedua saat berusia 48 tahun. Kakek dari pihak ayah meninggal dunia akibat infark myocard.

Sampel mempunyai indeks massa tubuh = 30.8 kg m 2 , menurut klasifikasi WHO termasuk obese kelas 1. Hasil kolesterol LDL 117 mg/dl dan trigliserida 185 mg/dl, lebih tinggi dari nilai normal, menunjukkan anak ini dislipidemia. Hasil pengukuran ketebalan rata-rata intima media arteri karotis 0,50 mm.

2. Sampel kelompok kontrol yang mempunyai polimorfisme adalah anak laki-laki berusia 15 tahun. Orang tuanya, baik ayah atau ibu sehat, tapi kakek dari pihak ayah maupun ibu meninggal akibat infark myocard. Indeks massa tubuh = 25.7

kg/m 2 , termasuk kategori pre obese sesuai klasifikasi WHO.

Ketebalan rata-rata intima media arteri karotisnya 0,60 mm.

3. Sampel kelompok kontrol yang juga mempunyai polimorfisme

adalah anak laki-laki berusia 20 tahun. Ayah dan ibunya sehat, nenek dari pihak ibu meninggal karena stroke hemorrhagik. Ketebalan intima media arteri karotisnya 0,60 mm.

Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Ultrasonografi ...

Dari uraian di atas tampak bahwa anak yang mempunyai polimorfisme MCP-1 A-2138T, baik yang termasuk kelompok kasus maupun kelompok kontrol mempunyai intima media arteri karotis yang lebih tebal dari rata-rata ketebalan intima media arteri karotis anak dengan rentang usia sama dan lebih tebal dari intima media arteri karotis anak dengan orang tua infark myocard berdasar penelitian terdahulu (Cuomo et al., 2002, Barra et al., 2009, Urbina et al., 2009, Davis et al., 2010). Stroke iskemia dan infark myocard merupakan komplikasi terkait aterosklerosis yang mempunyai patogenesis serupa, mempunyai faktor risiko yang sama. Perbedaannya hanyalah pada kualitas dan kuantitas faktor risiko. Data pada penelitian ini dibandingkan dengan data anak dengan orang tua infark myocard karena belum pernah dilakukan penelitian pada anak dengan orang tua stroke iskemia sebelumnya. (Arakelyan, et al., 2005, Bucova, et al., 2009).

Dua anak dengan polimorfisme MCP-1 A-2138T di atas mempunyai riwayat keluarga dengan penyakit infark myocard dan mempunyai indeks massa tubuh lebih dari 25 (Yueniwati Y., 2012). Pada penelitian Iwai dkk. tahun 2006, polimorfisme A-2138T ditemukan pada penderita infark myocard di Jepang dengan

indeks massa tubuh lebih dari 25 kg/m 2 . Mengingat polimorfisme mempunyai kemungkinan diwariskan, maka kemungkinan anak dengan polimorfisme MCP-1 A-2138T ini mendapat warisan polimorfisme MCP-1 A-2138T dari orang tuanya. Tentu saja perlu penelitian lanjut untuk membuktikan adanya pewarisan polimorfisme MCP-1 A-2138T tersebut (Yueniwati Y., 2012).

Sampai saat ini, belum pernah dilaporkan adanya temuan polimorfisme MCP-1 G-2464A, sehingga polimorfisme MCP-1 G-2464A pada penelitian ini benar-benar baru dan spesifik. Polimorfisme MCP-1 G-2464A juga terletak pada situs promoter, upstream dari start site MCP-1. Pada penelitian ini, polimorfisme ditemukan pada sampel kasus yaitu anak dengan orang tua stroke iskemia. Sampel ini perempuan berusia 19 tahun dengan ibu penderita stroke iskemia, serangan stroke pada saat ibu berusia

32 tahun. Kakek dari pihak ayah juga penderita stroke iskemia dan hipertensi. Nenek dari pihak ibu penderita hipertensi. Kolesterol

Bab 12 – Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Variasi Genetika

Pada penelitian ini terlihat bahwa anak dengan polimorfisme, mempunyai intima media arteri karotis yang lebih tebal dari anak dengan rentang usia yang sama. Perhitungan risiko relatif dengan rasio Odds menunjukkan anak dengan polimorfisme gen pengkode MCP-1 mempunyai kemungkinan 1,471 kali untuk mengalami penebalan intima media arteri karotis daripada anak tanpa polimorfisme. Hasil penelitian tersebut menegaskan pentingnya pemeriksaan genetika, khususnya analisis polimorfisme gen pengkode MCP-1 pada anak dengan faktor risiko aterosklerosis umumnya dan stroke iskemia khususnya. Dengan demikian, apabila didapatkan polimorfisme dapat dilakukan penatalaksanaan dini aterosklerosis berupa tindakan preventif terhadap faktor risiko lain (Yueniwati Y., 2012).

Polimorfisme MCP-1 yang ditemukan, keduanya merupakan polimorfisme pada situs promoter MCP-1. Anak dengan polimorfisme pada situs promoter MCP-1 pada penelitian ini mempunyai intima media arteri karotis lebih tebal daripada anak dengan rentang usia yang sama. Peningkatan ketebalan intima media arteri karotis tersebut dapat diterangkan sebagai berikut. Polimorfisme pada situs promoter akan meningkatkan aktivitas transkripsional MCP-1 yang bekerja secara sinergis dengan reseptornya yaitu CC Chemokine Receptor 2 (CCR2) sehingga aktivitas biologi reseptor CCR2 meningkat. Akibatnya, terjadi peningkatan aktivitas biologi sistem MCP-1/CCR2 messenger, dan terjadi peningkatan rekrutmen lokal monosit pada tempat injuri di dinding arteri (Yueniwati Y., 2012). Sistem MCP-1/CCR2 telah diketahui mempengaruhi risiko terjadinya aterosklerosis sehingga peningkatan aktivitas sistem MCP-1/CCR2 messenger akan menyebabkan peningkatan kejadian aterosklerosis (Nyquist, et al., 2009, Nyquist, et al., 2010).

Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Ultrasonografi ...

Adanya pengaruh polimorfisme pada situs promoter MCP-1 terhadap peningkatan ketebalan intima media arteri karotis telah dilaporkan pada beberapa penelitian yaitu adanya polimorfisme MCP-1 G-927C dan A-2578G yang secara signifikan berhubungan dengan peningkatan ketebalan intima in vitro pada penderita stroke iskemia (Brenner et al., 2006). Polimorfisme MCP-1 G–362C pada populasi kulit hitam yang berhubungan dengan peningkatan ketebalan intima media arteri karotis dan risiko aterosklerosis karotis (Nyquist et al., 2009). Polimorfisme pada situs promoter MCP-1 G–928C berhubungan dengan peningkatan ketebalan intima media arteri karotis invitro dan peningkatan risiko aterosklerosis karotis (Nyquist et al., 2009, Nyquist et al., 2010). Diketahui ketebalan intima media arteri karotis meningkat ± 0,036 mm untuk setiap C allele yang tampak. AC berhubungan dengan tebalnya intima media arteri karotis, CG berhubungan dengan tipisnya intima media arteri karotis (Brenner, et al., 2006).

Berbeda dengan beberapa penelitian lain yang dilakukan pada kondisi terkait aterosklerosis, pada penelitian ini tidak didapatkan polimorfisme MCP-1 pada basa ke -2518. Polimorfisme pada basa ke -2518 ini sebenarnya yang diharapkan dapat ditemukan pada penelitian ini mengingat banyaknya laporan penelitian adanya polimorfisme di lokasi tersebut pada kondisi terkait aterosklerosis (Tabara et al., 2003, Cermakova et al., 2005, Yuasa et al., 2009), dan adanya hubungan polimorfisme MCP-1 A-2518G dengan kejadian stroke iskemia (Buraczynska, et al., 2010).

Beberapa penelitian juga menunjukkan hubungan poli- morfisme MCP-1 G-2518A dengan ketebalan intima media arteri karotis. Yuasa (2009) mendapatkan polimorfisme G-2518A, berhubungan secara signifikan dengan peningkatan ketebalan intima media arteri karotis (Yuasa, et al., 2009). Sementara itu, Tabara (2003) mendapatkan polimorfisme MCP-1 G-2518A, berhubungan dengan level MCP-1 tapi tidak berhubungan dengan ketebalan intima media arteri karotis (Tabara et al., 2003). Posisi basa -2518 terletak di situs promoter yang merupakan area transkripsi utama. Diketahui bahwa transkripsi MCP-1 terjadi pada fase awal aterosklerosis. Polimorfisme MCP-1 G-2518A

Bab 12 – Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Variasi Genetika

Polimorfisme pada regio pengontrol yaitu substitusi G-2518A, sudah teridentifikasi dan menunjukkan pengaruh terhadap transkripsi gen. Dilaporkan genotipe GG dari -2518 gen MCP-1 berhubungan dengan kejadian penyakit arteri koroner (Tabara, et al., 2003).

Adanya perbedaan temuan polimorfisme genetika di atas kemungkinan disebabkan perbedaan populasi dan geografis. Diketahui bahwa populasi dan geografis menyebabkan perbedaan polimorfisme genetika (Zhong et al., 2010). Sampai saat ini, belum pernah diteliti peta polimorfisme populasi Indonesia dan populasi Jawa khususnya sehingga penelitian genetika pada populasi Jawa masih merupakan lahan luas yang harus diteliti demi tindakan preventif, prediktif, dan penatalaksanaan dini berbagai penyakit (Yueniwati Y., 2012).

Transkripsi MCP-1 berperan terhadap beratnya stroke (Hughes, et al., 2002, Schilling et al., 2009). Transkripsi MCP-1 dipengaruhi oleh beberapa faktor risiko seperti hipertensi, hiperkolesterol, merokok, dan diabetes (Nyquist et al., 2010). Untuk mengendalikan kemungkinan pengaruh faktor risiko tersebut sampel penelitian diperiksa tekanan darah, profil lipid, dan kadar glukosa darah. Kriteria inklusi semua sampel adalah tidak merokok. Semua sampel tekanan darahnya normal, kadar glukosanya normal dan tidak merokok. Profil lipid pada penelitian ini merupakan variabel yang tidak bisa dikendalikan. Terdapat hubungan antara profil lipid dengan MCP-1. Ekspresi monosit meningkat pada hiperkolesterolemia. Tingginya kadar LDL plasma meningkatkan ekspresi CCR2 monosit dan respon kemotaksis terhadap stimuli eksternal. Hal tersebut meningkatkan rekrutmen monosit ke intima dan mempercepat pembentukan lesi aterosklerosis. Sebaliknya, HDL membantu menurunkan ekspresi CCR2 dan kemotaksis mediated MCP-1 yang berakibat menurunkan monosit di dinding arteri. Penelitian invitro menunjukkan sel endotel dapat memproduksi MCP-1 sebagai respon terhadap LDL (Arakelyan, et al., 2005).

Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Ultrasonografi ...

Dua anak dengan polimorfisme mempunyai indeks massa tubuh lebih dari 25 kg/m 2 , satu anak mengalami dislipidemia. Hasil ini sesuai hasil penelitian yang dilakukan pada anak penderita infark myocard, yaitu anak-anak penderita infark myocard mempunyai kecenderungan obesitas dan dislipidemia (Cuomo et al., 2002, Barra et al., 2009). Anak dengan polimorfisme juga mengalami dislipidemia. Hasil penelitian di atas menunjukkan perlunya penelitian lebih lanjut mengetahui pengaruh polimorfisme gen pengkode MCP-1 terhadap profil lipid dan massa lemak tubuh. Pada penelitian ini didapatkan hasil bahwa polimorfisme bukan merupakan faktor risiko dislipidemia maupun massa lemak tubuh. Kemungkinan hal tersebut disebabkan umur sampel yang masih muda sehingga saat ini belum terlihat pengaruh (Yueniwati Y., 2012).

Berdasarkan hasil penelitian di atas, terdapat beberapa hal yang harus diperhatikan seperti yang dijelaskan berikut ini. Pertama, telah ditemukan dua polimorfisme pada promoter MCP-1 yang baru dan spesifik, yaitu A-2138T dan G-2464A. Kedua, anak populasi Jawa dengan polimorfisme mempunyai intima media arteri karotis yang lebih tebal daripada intima media arteri karotis anak pada rentang umur yang sama. Anak populasi Jawa dengan polimorfisme mempunyai kemungkinan 1,471 kali untuk mengalami penebalan intima media arteri karotis daripada anak tanpa polimorfisme (Yueniwati Y., 2012).

Sementara itu, terdapat beberapa hal yang sebaiknya diperhatikan dengan hasil penelitian ini, antara lain pertama, perlu dilakukan evaluasi genetika polimorfisme MCP-1 pada anak dengan risiko stroke iskemia dan aterosklerosis sehingga dapat dilakukan tindakan preventif terhadap faktor risiko lain dan penatalaksanaan dini. Kedua, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menentukan polimorfisme promoter MCP-1 yang ditemukan fungsional atau nonfungsional dengan menilai ekspresi gen (Yueniwati Y., 2012).

Bab 12 – Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Variasi Genetika