Variasi Genetika pada Lokasi -156

12.4.5 Variasi Genetika pada Lokasi -156

Hasil sekuensing promoter OPN kemudian dianalisis dengan menggunakan program CLC Main Workbench 6 untuk melihat ada tidaknya mutasi. Hasil analisis pada basa -156 menunjukkan adanya mutasi pada beberapa sampel. Mutasi yang terjadi adalah penambahan basa guanin. Berikut adalah hasil analisis hasil sekuensing dengan menggunakan program CLC Main Workbench 6 (Yueniwati Y., 2014).

10E TGGTTT---- TTTTTTGTTT TAACCACA-- 755 1011 TG-TTT---- TTTTTTGTTT TAACCACA-- 783 9E TG-TTT---- TTTTTTGTTT TAACCACA-- 757 16E TGGTTT---- TTTTTTGTTT TAACCACA-- 764 15E TGGTTT---- TTTTTGGTTT AACCAACA-- 759

15N TG-TTT---- TTTTTTGTTT TAACCACA-- 755 12E TG-TTT---- TTTTTTGTTT TAACCACA-- 873 11N TGGTTT---- TTTTTTGTTT TAACCACA-- 753 14E TG-TTT---- TATTTTGTTT AAACCACA-- 756 2E TGGTTT---- TTTTTGGTTT TACCCCCA-- 769 13N TGGTTT---- TTTTTTGTTT TAACCACA-- 762 10N TG-TTT---- TTTTTTTGTT TTACCCCC-- 762 14N TG-TTT---- TTTTTTGTTT TAACCACA-- 760

1E TGGTTT---- TTTTTTGTTT TAACCACA-- 765 11E ----------

---------- 695 2N TGGTTT---- TTTTTGGAAC -AACTCCA-- 772 9N TGATTT---- TTTTTGTATT AAACCAAT-- 761

----------

6E TG-TGT---- TTTTTTGGTT AAACCACC-- 770 5N TGAATT---- ATTATGGTTT CAACCACA-- 771 13E TGTTTT---- TTTTTG--TT TAACCCCA-- 761 16N CCATAT---- AGATATGTCT TAACGTAT-- 758 1N TGTGTT---- TTCTTAG---

---------- 751 4E --GTTT---- TTCCTCAGAA AAACTTCT-- 770 4N GACCTT---- CCTAGAGATA CACTCTCATC 775 12N TGATTT---- TTTTT-GTTT TAACTACA-- 761 3E TGAATT---- ACTGTGTCTC C--------- 752 6N TGTTTT---- TTTTCATTTT AAACCA---- 762 7E ----------

---------- 199 5E AAATTGGAAA TAATTTTTGG TAACCATTTA 1320 8N ----------

----------

---------- 203 8E ----------

----------

---------- 197 3N ----------

----------

---------- 201 7N ----------

----------

---------- 201 Consensus 100% TG-TTT---- TTTTTTGTTT TAACCACA--

----------

Conserva tion 0%

Sumber: Yueniwati Y., 2014

Gambar 12.35 Analisis mutasi basa nomor -156 pada hasil PCR dengan primer forward

Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Ultrasonografi ...

11E AAC-AAAAAC GCACACACAC AATCTACAGT 250 9E AAC-AAAAAC GCACACACAC AATCTACAGT 250 15N AAC-AAAAAC GCACACACAC AATCTACAGT 247 12E AAC-AAAAAC GCACACACAC AATCTACAGT 249 10E

1011rev AACCAAAAAC GCACACACAC AATCTACAGT 250 AAC-AAAAAC GCACACACAC AATCTACAGT 276

11N AACCAAAAAC GCACACACAC AATCTACAGT 252 13N

14E AACCAAAAAC GCACACACAC AATCTACAGT 250 AAACAAAAAC GCACACTCAC AATCTACAGT 352 10N AACCAAAAAC GCACACACAC AATCTACCGT 258 14N A-TCAAAAAC GCACTCTCCC AATCTACAGT 257

4E AACCAAAAAC GCACACTCAC AATCTACCGT 262 1E ATCTAAAAAC GCACACACAC AATCTACAGT 255

16E AACCAAAAAC GCACACACAC AATCTACAGT 256 12N TAT-AAAACC GCACTCTCCC AATCTACGGT 259 7E AACCAAAAAC GCACACACAC AATCTACCGT 258 3E AACCAAAAAC GCCCACACAC CTCCAACAGT 249

13E GAC-GCAAAC GCTCCCCCAC AATCTACGGT 261 15E

5E AACCAAAACC CACCCCCACC ATCCAACATT 250 AACCAAAACC CCCCCCCCCC ATCCAACGTT 251 6E AACCAAAACC CCCCCCCCCC ATCCAACATT 249

5N AACCAAAACC CCCCCCCCCC ATCCTCCGTT 257 4N ----------

--------------------- 205 2E ----------

--------------------- 200 2N ----------

--------------------- 202 10N ----------

--------------------- - 1N ----------

--------------------- 2 6N ----------

--------------------- 2 8E ----------

---------- 2 8N 7N ----------

----------

--------------------- 2 ----------

---------- 2 9N ----------

----------

---------- 55 8N Consensus ----------

----------

---------- 12 100% AAC-AAAAAC

----------

GCACACACAC AATCTACAGT Conserva tion 0%

Sumber: Yueniwati Y., 2014

Gambar 12.36 Analisis mutasi basa no -156 pada hasil sekuensing dengan primer reverse

Mutasi terjadi pada basa nomor -156 yaitu terjadi insersi atau penyisipan basa guanin. Mutasi ini terjadi pada enam sampel, baik pada sampel kontrol dan sampel kasus. Tidak semua sampel yang disekuensing dengan primer forward terlihat pada primer reverse, begitu pula sebaliknya (Yueniwati Y., 2014).

Insersi merupakan bagian dari frameshift mutation (mutasi pergeseran kerangka) yang dapat berupa insersi atau delesi. Insersi merupakan penambahan basa pada rangkaian nukleotida. Jika insersi ini terjadi akan menyebabkan perubahan kelompok kodon. Perubahan kelompok kodon akan menyebabkan perubahan stop kodon sehingga translasi akan terus berlanjut hingga stop kodon selanjutnya. Namun, insersi ini tidak berpengaruh pada perubahan penterjemahan asam amino, sebab promoter bukanlah bagian dari gen yang ditrankripsikan (Yueniwati Y., 2014).

Mutasi pada lokasi basa nukleotida -156 sudah pernah ditemukan pada penelitian terdahulu yang juga meneliti pengaruh

Bab 12 – Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Variasi Genetika

Pada penelitian lain dijelaskan mengenai hubungan antara peningkatan kadar OPN dengan peningkatan sintesis kolesterol dengan niali signifikansi p = 0.001 (Luomala, 2007). Adapun obesitas dapat menjadi faktor penting pada proses aterosklerosis pada intima media arteri karotis. (Kotsis et al., 2006), sedangkan indeks massa tubuh juga diketahui berkorelasi dengan peningkatan kadar protein OPN. Penelitian tersebut menjelaskan bahwa kelompok obesitas mempunyai kadar OPN dalam plasma yang lebih tinggi dari kelompok kontrol (Gursoy, 2010), sedangkan nilai rata-rata ketebalan intima media arteri karotis lebih tinggi secara signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol p < 0.001 (Sharma et al., 2009).

Berdasarkan penelitian ini, diketahui hubungan variasi genetika yang terjadi dengan penebalan intima media arteri karotis yang ditunjukkan dengan nilai Odd Ratio yaitu 2.100 (CI 0.297–14.875), artinya bahwa variasi genetika tidak bermakna sebagai faktor risiko. Penelitian ini memberikan kesimpulan bahwa tidak ada pengaruh variasi genetika terhadap penebalan intima media arteri karotis. Begitu pula dengan variabel lain yaitu besarnya profil lipid dan indeks massa tubuh yang berturut-turut memiliki nilai Odd Ratio 1.500 (CI 0.146–15.461) dan 1.190 (CI

Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Ultrasonografi ...

0.113–12.585). Besarnya Odd Ratio tersebut menunjukkan variasi genetika tidak berpengaruh secara signifikan terhadap profil lipid maupun indeks massa tubuh (Yueniwati Y., 2014).

Terdapat enam sampel yang dinyatakan mengalami variasi genetika dinilai dari analisis menggunakan CLC Main Workbench 5 dan program Sequencher. Dua di antaranya adalah kelompok kasus (10.52% dari seluruh sampel kasus) dan empat adalah sampel kontrol (30.76% dari seluruh sampel kontrol). Berikut adalah penjabaran masing-masing karakteristik sampel yang positif terjadi variasi genetika (Yueniwati Y., 2014).

1. Terdapat dua sampel kontrol yang mengalami variasi genetika

dan mempunyai ketebalan intima media arteri karotis kanan dan kiri lebih dari 0.05 mm, sedangkan profil lipid dan indeks massa tubuh normal.

2. Terdapat dua sampel kontrol yang mengalami variasi genetika,

sedangkan ketebalan intima media arteri karotisnya di bawah

0.05 mm. Salah satu sampel mempunyai total kolesterol di atas 200 mg/dl dan indeks massa tubuhnya normal, sedangkan sampel lainnya mempunyai total kolesterol normal dan indeks

massa tubuh di atas 25 kg/m 2 yang masuk dalam kategori obesitas.

3. Terdapat dua sampel kasus yang mengalami variasi genetika dan keduanya mempunyai ketebalan intima media arteri karotis di atas 0.05mm, sedangkan total kolesterol dan indeks massa tubuhnya normal.

Dari deskripsi di atas diketahui bahwa beberapa sampel menunjukkan adanya kecenderungan hubungan antara variasi genetika dengan ketebalan intima media arteri karotis. Pada poin 1 dijelaskan bahwa terdapat dua sampel kontrol yang mengalami penebalan intima media arteri karotis dari empat sampel kelompok kontrol yang mengalami variasi genetika (50%). Padahal, kelompok kontrol merupakan kelompok dengan orang tua tanpa penyakit kardiovaskular yang tidak diharapkan mengalami variasi genetika (Yueniwati Y., 2014).

Bab 12 – Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Variasi Genetika

Jika dikaji lebih lanjut, terdapat kemungkinan lain penyebab terjadinya penebalan intima media arteri karotis selain confounding factor yang telah dianalisis. Meningkatnya kadar osteopontin dalam tubuh karena overekspresi dapat menyebabkan peningkatan potensi invasi sel kanker dan juga berpengaruh dalam progresivitas kanker (Pan et al., 2003). Selain itu, OPN juga dapat meregulasi infiltrasi makrofag selama proses inflamasi dan jumlah OPN plasma ditemukan berhubungan dengan beberapa penyakit inflamasi seperti Osteoartritis (Sudhir et al., 2012). Dalam penelitian ini, orang tua sampel tidak menjalani pemeriksaan terkait dengan segala penyakit yang pernah diderita oleh orang tua di luar penyakit kardiovaskular. Kemungkinan sampel kontrol yang mengalami variasi genetika dengan penebalan intima media arteri karotis memiliki orang tua dengan penyakit-penyakit lain misalnya kanker atau penyakit-penyakit inflamasi (Yueniwati Y., 2014).

Pada poin 2 terdapat dua sampel kontrol yang mengalami variasi genetika namun tidak mengalami penebalan intima media arteri karotis dari empat sampel kelompok kontrol yang mengalami variasi genetika (50%). Penebalan intima media merupakan salah satu marker yang menandai meningkatnya jumlah osteopontin plasma. Secara umum, OPN memiliki beberapa fungsi yang akan mempengaruhi fisiologis tubuh. Salah satunya adalah ketebalan intima media arteri karotis. Selain itu, overekspresi OPN juga dapat meningkatkan jumlah sel-sel proinflamasi yang berkorelasi dengan terjadinya penyakit-penyakit inflamasi (Yueniwati Y., 2014).

OPN juga dapat meningkatkan jumlah osteoklas dan sel-sel yang berperan dalam mekanisme bond remodeling lainnya. Fungsi- fungsi di atas kemungkinan tidak berjalan sama pada masing- masing individu. Bisa jadi, satu individu dengan variasi genetika SNP -156 mengalami penebalan intima media arteri karotis, sementara pada individu lain yang juga mengalami varisi genetika di titik yang sama mengalami gejala lain misalnya peningkatan jumlah sel- sel proinflamasi yang menyebabkan penyakit-penyakit inflamasi seperti lupus atau osteoartritis (Farouk et al., 2009). Oleh karena itu, dalam kasus poin 2 terdapat kemungkinan bahwa sampel kelompok ini tidak mengalami penebalan intima media arteri karotis, namun

Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Ultrasonografi ...

mengalami bentuk fisiologis lain akibat terjadinya variasi genetika. Sayangnya bentuk fisiologis lain itu tidak diteliti dalam penelitian ini atau belum diketahui secara pasti (Yueniwati Y., 2014).

Pada poin 3, terdapat dua sampel kasus yang kedua-duanya mengalami penebalan intima media arteri karotis (100% dari sampel kasus yang mengalami variasi genetika). Hal ini telah senada dengan berbagai literatur yang menjelaskan hubungan antara variasi genetika pada titik G-156GG dengan penebalan intima media arteri karotis. Poin 3 kembali menguatkan penelitian-penelitian sebelumnya bahwa terdapat kecenderungan variasi genetika pada titik G-156GG berhubungan dengan penebalan intima media arteri karotis (Yueniwati Y., 2014).

Secara teori, kecenderungan di atas dapat dijelaskan sebagai berikut. Dalam sebuah penelitian (Giacopelli, 2004) dijelaskan bahwa kehadiran dua basa guanin dalam urutan DNA di lokasi -156 menyebabkan terbentuknya binding site untuk faktor RUNT. RUNX2 yaitu salah satu faktor transkripsi dapat berikatan dengan binding site yang terbentuk karena adanya insersi G pada urutan basa. Ikatan ini memiliki afinitas yang besar sehingga dapat meningkatkan aktivitas transkripsi promoter OPN. Aktivitas transkripsi promoter OPN ini menyebabkan peningkatan konsentrasi OPN dalam plasma (Yueniwati Y., 2014).

OPN banyak diekspresikan pada sel makrofag di jaringan adiposa manusia. Banyaknya jaringan adiposa juga berhubungan dengan terjadinya obesitas. Peningkatan aktivitas transkripsi OPN juga menyebabkan terjadinya peningkatan rekrutmen lokal monosit pada tempat injuri di dinding arteri sehingga akan meningkatkan risiko terjadinya aterosklerosis (Yueniwati Y., 2014).

Pengukuran OPN plasma sangat dibutuhkan untuk melihat akibat langsung dari terjadinya variasi genetika pada titik G-156GG. Sebab peningkatan OPN plasma tidak hanya berhubungan dengan ketebalan intima media arteri karotis, tapi juga dengan parameter lain seperti jumlah sel proinflamasi atau peningkatan jumlah osteoklas dan sel yang berperan dalam bond remodeling (Yueniwati Y., 2014).

Bab 12 – Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Variasi Genetika

Selain titik -156, terdapat dua titik lain yang sering dilaporkan berhubungan dengan penebalan intima media arteri karotis. Titik- titik itu adalah C-443T dan T-66G. Kedua titik ini telah banyak dilaporkan dapat memprediksi risiko seseorang mengalami penyakit kardiovaskular, terutama pada titik T-66C. Sementara itu, titik C-44T belum diketahui dengan tepat konsekuensi terjadinya mutasi pada titik ini terhadap regulasi transkripsi protein OPN (Yueniwati Y., 2014).