Analisis mutasi pada basa no. -443

12.3.6 Analisis mutasi pada basa no. -443

Hasil analisis pada basa nomor -443 menunjukkan adanya mutasi pada beberapa sampel yaitu substitusi basa timin menjadi sitosin. Mutasi terjadi pada enam belas sampel kasus dan lima sampel kontrol. Sekuensing dua arah tersebut menunjukkan terjadinya mutasi pada lokasi yang sama, namun pada beberapa sampel yang berbeda. Berikut (Gambar 12.25-12.26), hasil analisis mutasi pada basa nomor -443 (Yueniwati Y., 2012).

Berdasarkan analisis hasil sekuensing, 11 sampel mengalami mutasi pada OPN forward dan 10 sampel pada OPN reverse. Namun, hanya 6 sampel yang dapat dikatakan mengalami mutasi yang terdiri dari 4 kelompok kasus dan 2 kelompok kontrol. Karena hanya 6 sampel tersebut yang mengalami mutasi yang sama, baik pada OPN forward maupun reverse. Berikut hasil ringkasannya (Yueniwati Y., 2012).

Tabel 12.11 Data mutasi sampel promoter OPN T-443C menggunakan program CLC main workbench 6.0

Daftar Sampel yang Mengalami Mutasi OPN Forward

OPN Reverse (Kelompok)

Ketebalan CA-IMT

10 N (S) 5 E (S) Sumber: Yueniwati Y., 2012

Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Ultrasonografi ...

wild type ATCACAAAGC TAAGCTTGAG 10E 9E ATCACAAAGC ATCACAAAGC TAAGCTTGAG TAAGCTTGAG TAGTAAAGGA TAGTAAAGGA TAGTAAAGGA CAGAGGCAAG CAGAGGCAAG --------TT --------TT --------TT T T C T G A A - - - 452 CAGAGGCAAG T T C T G A A - - - 481 T T C T G A A - - - 455

12E 15E 16E ATCACAAAGC ATCACAAAGC TAAGCTTGAG TAAGCTTGAG TAGTAAAGGA TAGTAAAGGA CAGAGGCAAG ATCACAAAGC TAAGCTTGAG TAGTAAAGGA CAGAGGCAAG CAGAGGCAAG --------TT --------TT --------TT T T C T G A A - - - 456 T T C T G A A - - - 461 ATCACAAAGC

--------TT T T C T G A A - - - 571 T T C T G A A - - - 453 11N 15N ATCACAAAGC TAAGCTTGAG 14E ATCACAAAGC ATCACAAAGC

TAAGCTTGAG

TAGTAAAGGA

--------TT C T C T G A A - - - 454 C T C T G A A - - - 466 13N 2E 14N 10N ATCACAAAGC ATCACAAAGC ATCACAAAGC TAAGCTTGAG TAAGCTTGAG

TAAGCTTGAG TAAGCTTGAG

TAGTAAAGGA TAGTAAAGGA TAGTAAAGGA

CAGAGGCAAG CAGAGGCAAG

CAGAGGCAAG

--------TT --------TT T T C T G A A - - - 450

--------TT T T C T G A A - - - 460 T T C T G A A - - - 459 11E 1E ATCACAAAGC ATCACTAACC TAAGCTTGAG TAATCTTGAA TAGTAAAGGA TAGTAAAGGA CAAAGGCAAG CAGAGGCAAG CAGAGGCAAG

--------TT TAGTAAAGGA TAGTAAAGGA TAAGCTTGAG TAGTAAAGGA

CAGAGGCAAG

CAGAGGCAAG

--------TT --------TT T T C T G A A - - - 462 T T C T G A A - - - 458 2N ATCACAAAGC ATCACAAAGC TAAGCTTGAG TAAGCTTGAG TAGTAAAGGA TAGTAAAGGA CAGAGGCAAG CAGAGGCAAG

CAGAGGCAAG

--------TT --------TT --------TT C T C T G A A - - - 470 C T C T G A A - - - 454 9N ATCACAAAGC

T T C T G A A - - - 458 5N 6E ATCACAAAGC CTCTCCAAGC TAAACTTGAG TAAGCTTGAG TAAGCTTGAG TAGTAAAGGA TAGTAAAGGA CAGAGGCAAG CAGAGGCAAG --------TT --------TT T T C T G A A - - - 468 C T C T G A A - - - 468 16N 13E 1N ATCACAAAGC ATCACAAAGC TAATCTTGAG TAGTAAAGGA CAGAGGCAAG CAGAGGCAAG

--------TT --------TT T T C T G A A - - - 455 TAATCTTGAG C T C T G A A - - - 460 TAGTAAAGGA TAGTAAAGGA CAGAGGCAAG --------TT C T C T G A A - - - 458

--------TT C T C T G A A - - - 469 ATCACAAAGC CTCTCTAAGC

12N 4N 4E ATCACAAAGC ATCACAAAGC TAAACTTGAG TAAGCTTGAG TAGTAAAGGA TAGTAAAGGA CAGAGGCAAG

--------TT T T C T G A A - - - 464 C T C T G A A - - - 458 6N TTCTCTAAGT ---------- TAATCTTGAG --------- TCGTAGAGGA ---------- CAGAGGCAAG ----------

TAAACTTGAG TTAGCTTGAG

TAGTAAAGGA TAGTAAA GA CAGAGGCAAG CAGAGGCAAG

--------TT --------TT T T C T G A A - - - 465

--------TT ---------- - - - - G T T - - - 67 C G C T G A A - - - 460 8N 5E 7E AGGTTAGGGT TAAAAAGGGG GAACT GA TGGGGCCAAA AGGTTTCCTT C C C T G G A A A A 840

3E CAGAGGCAAG

---------- ---------- ---------- - - - - - - - - - - 93 - - - - - - - - - - 94 - - - - - - - - - - 451 Consensus

---------- - - - - - - - - - - 88 7N --CAA-GGGA CAATTTTTAT ---------- CTGTAACGGA ----GACGGG CAAGGGCAA- CCGGGGAG -

3N 8E ---------- ---------- ----------

---------- --------AG

TTGCAAAGTG --------GG

C--------- CAGAGG----

--------TT TTCTGAA--- tion 0% Sequence Logo

Conserva 100% ATCACAAAGC

Sumber: Yueniwati Y., 2012 Gambar 12.25 Analisis mutasi basa no -443 pada hasil sekuensing dengan

primer OPN forward

Sumber: Yueniwati Y., 2012 Gambar 12.26 Analisis mutasi basa no -443 pada hasil sekuensing dengan

primer OPN reverse

Bab 12 – Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Variasi Genetika

Kemudian, dilakukan perbandingan analisis hasil sekuensing menggunakan program lain yaitu Sequencher 5.1. Pada program ini, digunakan persen kemiripan sampel dengan wild type sebesar 80% untuk dapat disejajarkan. Dengan demikian, tidak semua sampel dapat disejajarkan pada program ini karena tidak memenuhi persen minimal kemiripan dengan wild type. Berikut hasil analisisnya (Gambar 12.27-12.28).

Berdasarkan hasil analisis menggunakan program tersebut,

10 sampel mengalami mutasi pada OPN forward dan 5 sampel

pada OPN reverse. Namun, hanya 4 sampel yang dapat dikatakan mengalami mutasi yang terdiri dari 3 kelompok kasus dan 1 kelompok kontrol. Perbedaan hasil analisis kedua program tersebut disebabkan perbedaan pengaturan persen kemiripan sampel dengan wild type-nya. Namun, kedua program tersebut menunjukkan mutasi yang sama pada sampel yang sama pula. Berikut hasil ringkasannya (Yueniwati Y., 2012).

Tabel 12.12  Data mutasi sampel promoter OPN T-443C menggunakan program Sequencher 5.1

Daftar Sampel yang Mengalami Mutasi

OPN Forward (Kelompok) Ketebalan CA-IMT (mm) OPN Reverse (Kelompok) 11 E (S)

6N (S) Sumber: Yueniwati Y., 2012

Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Ultrasonografi ...

Page #1

12N # – 11

GTAAATGACAGAGGCAAGTT CTCTGAACTC 6N

AGCTTGAGTA

GTAGAGGACAGAGGCAAGTT CGCTGAACTC 11E

ATCTTGAGTC

> # 1> NNAAGGACAAAGGCAAGTT CTCTGAACTC 1N

> # 1> NNAAGGACAGAGGCAAGTT CTCTGAACTC 9N

> # 1> NNAAGGACAGAGGCAAGTT TTCTGAACTC 14E

> # 1> NNAAGGACAGAGGCAAGTT CTCTGAACTC 16N

> # 1> NNAAGGACAGAGGCAAGTT TTCTGAACTC 6E > # 1>

NNAAGGACAGAGGCAAGTT CTCTGAACTC 13N

> # 1> NNAAGGACAGAGGCAAGTT TTCTGAACTC 13E

> # 1> NNAAGGACAGAGGCAAGTT CTCTGAACTC 4E > # 1>

NNAAGGACAGAGGCAAGTT CTCTGAACTC 2N

> # 1> NNAAGGACAGAGGCAAGTT CTCTGAACTC 5N

> # 1> NNAAGGACAGAGGCAAGTT TTCTGAACTC 12E

> # 1> NNAAGGACAGAGGCAAGTT TTCTGAACTC 11N

> # 1> NNAAGGACAGAGGCAAGTT TTCTGAACTC Wt

> # 1> NNAAGGACAGAGGCAAGTT TTCTGAACTC 15E

> # 1> NNAAGGACAGAGGCAAGTT TTCTGAACTC 9E > # 1>

NNAAGGACAGAGGCAAGTT TTCTGAACTC 14N

> # 1> NNAAGGACAGAGGCAAGTT TTCTGAACTC 16E

> # 1> NNAAGGACAGAGGCAAGTT TTCTGAACTC 2E > # 1>

NNAAGGACAGAGGCAAGTT CTCTGAACTC 10E

> # 1> NNAAGGACAGAGGCAAGTT TTCTGAACTC 15N

> # 1> NNAAGGACAGAGGCAAGTT TTCTGAACTC 10N

> # 1> NNAAGGACAGAGGCAAGTT TTCTGAACTC 1E > # 1>

NNAAGGACAGAGGCAAGTT TTCTGAACTC

AKNT

GAGTmNGTAAAGGACAGAGGCAAGTT TTCTGAACTC

Sumber: Yueniwati Y., 2012 Gambar 12.27 Analisis mutasi basa no -443 pada hasil sekuensing dengan

primer OPN forward

Page #10 Wt reverse

A G G A G GT C A G AAA A CTTGC C T C T G TC C TT 12N

A G G A G TT C A G AAA A CTTGC C T C T G TC C TT

A G G A G TT C A G AAA A CTTGC C T C T G TC C TT 13E

1E #422

A G G A G TT C A G AGA A CTTGC C T C T G TC C TT 14E

A G G A G TT C A G AGA A CTTGC C T C T G TC C TT

A G G A G TT C A G AGA A CTTGC C T C T G TC C TT 14N

4E #422

A G G A G TT C A G AAA A CTTGC C T C T G TC C TT 16E

A G G A G TT C A G AAA A CTTGC C T C T G TC C TT 16N

A G G A G TT C A G AAA A CTTGC C T C T G TC C TT

A G G A G TT C A G AAA A CTTGC C T C T G TC C TT 11N

3E #422

A G G A G TT C A G AAA A CTTGC C T C T G TC C TT 10E

A G G A G TT C A G AAA A CTTGC C T C T G TC C TT

A G G A G TT C A G AAA A CTTGC C T C T G TC C TT 12E

9E #422

A G G A G TT C A G AAA A CTTGC C T C T G TC C TT 15N

A G G A G TT C A G AAA A CTTGC C T C T G TC C TT 13N

A G G A G TT C A G AAA A CTTGC C T C T G TC C TT 15E

A G G A G TT C A G AGA A CTTGC C : C T G TC C TT

7E #422

A G G A G TT C A G AGA A CTTGC C T C T G TC C TT

A G G A G TT C A G AAA A CTTGC C T C T G TC C TT

Sumber: Yueniwati Y., 2012 Gambar 12.28 Analisis mutasi basa no -443 pada hasil sekuensing dengan

primer OPN reverse

Bab 12 – Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Variasi Genetika

12.3.7 Uji kekuatan hubungan kelompok mutasi dan non mutasi terhadap ketebalan intima media arteri karotis serta hubungan profil lipid, indeks massa tubuh dan glukosa puasa terhadap peningkatan ketebalan intima media arteri karotis

Pada uji ini didapatkan hasil bahwa variasi genetika tidak bermakna sebagai faktor risiko peningkatan ketebalan intima media arteri karotis. Kolesterol total, indeks massa tubuh serta glukosa puasa juga tidak bermakna sebagai faktor risiko peningkatan ketebalan intima media arteri karotis (Yueniwati Y., 2014).

Pada penelitian ini didapatkan 6 sampel mengalami mutasi yang terdiri dari 4 kelompok kasus dan 2 kelompok kontrol dengan deskripsi sebagai berikut (Yueniwati Y., 2014).

1. Sampel kelompok kasus yang mengalami variasi genetika T-443C adalah anak laki-laki berusia 18 tahun dengan orang tua stroke iskemia. Sampel mempunyai nilai indeks massa

tubuh sebesar 29,2 kg/m 2 yang termasuk dalam kategori overweight (WHO). Nilai kolesterol LDL adalah 110 mg/dL yang menunjukkan anak tersebut dislipidemia. Sementara itu, hasil pengukuran ketebalan rata-rata intima media arteri karotisnya adalah 0,06 mm.

2. Sampel kelompok kasus yang juga mengalami variasi genetika T-443C adalah anak laki-laki usia 18 tahun. Nilai indeks massa tubuh normal yaitu 22,2 kg/m 2 . Nilai kolesterol normal dengan

ketebatalan rata-rata intima media arteri karotis 0,06 mm.

3. Sampel kelompok kasus berikutnya adalah anak perempuan berusia 11 tahun dengan nilai indeks massa tubuh 17,26 kg/m2 yang termasuk dalam kategori underweight. Nilai trigliserida lebih tinggi dari normal yaitu 170 mg/dL. Ketebalan rata-rata intima media arteri karotis 0,06 mm.

4. Sampel kelompok kasus yang terakhir adalah anak laki- laki usia 15 tahun. Indeks massa tubuh sebesar 18,4 kg/m 2 ( underweight) dengan nilai ketebalan rata-rata intima media arteri karotis 0,05 mm.

5. Sampel kelompok kontrol adalah anak laki-laki berusia 19 tahun dengan nilai indeks massa tubuh 17,9 kg/m 2 yang

Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Ultrasonografi ...

masuk dalam kategori underweight. Nilai rata-rata ketebalan sampel ini adalah 0,04 mm.

6. Sampel kelompok kontrol yang juga mengalami mutasi adalah

anak perempuan usia 20 tahun. Indeks massa tubuhnya adalah 21,2 kg/m 2 sehingga masuk dalam kategori normal. Nilai rata-rata ketebalan intima media arteri karotisnya adalah 0,045 mm.

Berdasarkan hasil tersebut, dapat dilihat 4 dari 6 sampel yang mengalami variasi genetika adalah sampel kelompok kasus yang memiliki ketebalan intima media arteri karotis lebih tebal daripada

2 kelompok kontrol yang juga mengalami variasi genetika. Berdasarkan nilai ketebalan intima media arteri karotis ini, dapat dikatakan bahwa anak dengan orang tua yang memiliki riwayat stroke iskemia mempunyai intima media arteri karotis yang lebih tebal daripada rata-rata ketebalan intima media arteri karotis pada anak dengan rentang usia sama yaitu 0,05 mm (Urbina et al., 2009). Hal ini sesuai dengan hasil penelitian terdahulu yang menyebutkan bahwa variasi genetika promoter osteopontin T-443C memiliki efek yang signifikan terhadap peningkatan ketebalan intima media arteri karotis akibat gangguan aktivitas transkripsi gen osteopontin (Brenner et al., 2006).

Adanya variasi genetika T-443C di daerah promoter osteopontin menyebabkan terjadinya pengikatan faktor transkripsi MYT1 dengan motif zinc finger pada daerah promoter. Pengikatan faktor transkripsi ini menyebabkan afinitas ikatan RNA polimerase terhadap promoter meningkat sehingga aktivitas transkripsinya juga meningkat. Akibatnya, terjadi overekspresi OPN yang menyebabkan proliferasi otot polos pembuluh darah terjadi lebih dini dan cepat. Akibatnya, penyempitan dan pengerasan pembuluh darah juga terjadi lebih cepat yang menyebabkan terjadinya penurunan pasokan darah ke berbagai organ, khususnya otak. Penurunan pasokan darah yang mengandung oksigen ke otak inilah yang menyebabkan terjadinya stroke iskemia (Yueniwati Y., 2014).

Dua sampel lain yang juga mengalami variasi genetika merupakan sampel kelompok kontrol yang pada penelitian ini

Bab 12 – Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Variasi Genetika

Overekspresi OPN juga ditemukan pada beberapa kondisi seperti arthritis kronis, infark myokard, fibrosis intersisial pada ginjal akibat obstruksi uropati, dan pada proses penyembuhan luka sebagai salah satu fungsi fisiologis OPN (Giacopelli et al., 2004). Berdasarkan hasil penelitian tersebut maka variasi genetika promoter osteopontin T-443C yang terjadi pada kelompok kontrol dimungkinkan berhubungan dengan kondisi lain seperti yang telah disebutkan. Dengan demikian, kelompok kontrol yang juga mengalami variasi genetika promoter osteopontin T-443C tidak mengalami peningkatan ketebalan intima media arteri karotis (Yueniwati Y., 2014).