sampel jaringan prostat untuk pewarnaan imunohistokimia p63 dan diamati oleh peneliti.
3.6.1. Pembuatan Sediaan Mikroskopis Sediaan mikroskopis dibuat dengan cara sebagai berikut:
1. Blok parafin yang telah dikumpulkan, disimpan dalam freezer sampai
cukup dingin, selanjutnya dipotong tipis dengan menggunakan mikrotom dengan tebal 4
μm. Setiap blok parafin dipotong ulang 1 kali untuk pulasan imunohistokimia p63.
2. Sampel blok parafin yang sudah dipotong tipis 4
μm ditempelkan pada kaca objek.
Pada pulasan imunohistokimia p63 digunakan kaca objek yang telah di- coating dengan poly-L-lysine atau sialanized preparat agar jaringan dapat
menempel pada kaca objek selama proses pulasan imunohistokimia. Proses pembuatan sialanized preparat kaca objek adalah sebagai berikut:
1. Kaca objek direndam seluruhnya dalam aseton selama 10 menit.
2. Masukkan
kaca objek dalam larutan APES 3-
aminopropyltriethoxysilene, cat no.A3548 sigma 5 ml + aseton 195 ml selama 10 menit.
3. Kaca objek selanjutnya dicuci dengan aquadest.
4. Keringkan dalam inkubator bersuhu 37
C selama satu malam. 5.
Kaca objek siap digunakan.
Universitas Sumatera Utara
Cara menempelkan potongan tipis pada kaca objek sialanized adalah menggunakan ujung pisau atau pinset yang runcing. Potongan tipis
dipisahkan dan diratakan dengan memasukkannya ke dalam air hangat. Setelah mengembang, pindahkan ke atas kaca objek. Selanjutnya kaca objek
diletakkan di atas alat pemanas hot plate suhu 50 C – 60
C selama 60 menit. Setelah parafin melunak, kaca objek dikeringkan dan potongan
jaringan siap untuk dipulas.
3.6.2. Prosedur Sebelum Pulasan Antibodi Primer
1. Siapkan preparat berupa potongan tipis jaringan 4
μm yang sudah ditempelkan pada kaca objek sialanized.
2. Deparafinisasi dengan mencelupkan preparat ke dalam cairan xylol
sebanyak 3 kali, masing-masing 5 menit. 3.
Rehidrasi dengan cara mencelupkan preparat secara berurutan dalam etanol absolut, 96, 80 dan 70, masing-masing selama 4 menit.
4. Cuci dengan air mengalir selama 5 menit.
5. Blocking preparat dengan mencelupkannya ke dalam endogen peroksidase
0,5 methanol 100 ml + H2O2 1,6 ml selama 30 menit. 6.
Cuci dengan air mengalir selama 5 menit. 7.
Masukkan preparat ke dalam larutan buffer sitrat dan dipanaskan di dalam microwave sebanyak 2 kali, masing-masing dengan power level 8 dan 1
selama 5 menit. 8.
Dinginkan selama 30 menit dalam suhu ruangan.
Universitas Sumatera Utara
9. Cuci dalam PBS pH 7,4 selama 3 menit dan keringkan air di sekitar
potongan jaringan. 10.
Tandai di sekeliling jaringan yang ingin dipulas dengan Pap Pen. 11.
Blocking preparat dengan meneteskan Normal Horse Serum 5 dan dibiarkan selama 15 menit di dalam rak inkubasi.
3.6.3. Protokol Pulasan Imunohistokimia p63 Dengan Menggunakan Metode REAL En Vision
