4.4.6 Uji In Vivo
Uji bahan vaksin terhadap mencit dilakukan dengan 4 perlakuan, yaitu kontrol normal, kontrol negatif, kultur inaktivasi dengan pemanasan
65 C selama 30 menit dan kultur inaktivasi dengan iradiasi. Pada kontrol
negatif, mencit di infeksikan atau disuntik dengan K. pneumoniae aktif, sedangkan pada kontrol negatif, mencit disuntikkan dengan NaCl 0,85.
Pada perlakuan pemanasan dan iradiasi kultur hasil inaktivasi iradiasi disuntikkan pada mencit.
4.4.7 Uji Tantang
Setelah 7 hari dari infeksi, mencit pada perlakuan pemanasan 65 C
selama 30 menit dan iradiasi 800 Gy ditantang dengan cara menyuntikkan isolat K. pneumoniae aktif pada mencit secara intraperitonial lalu dilihat
profil protein pada selang waktu 0, 6, 24, 48 jam, untuk mengetahui respon imunitasnya.
4.4.8 Pengamatan Persentasi Mortalitas
Diamati persentase mortalitas yang terjadi setiap hari selama dua minggu pengamatan.
Mortalitas = ∑ mencit mati X 100 =………
∑ mencit awal
4.4.9 Pengambilan Serum Darah
Diambil darah melalui jantung mencit sebanyak 2 ml pada masing- masing perlakuan kontrol normal, kontrol negatif, pemanasan 65
C selama 30 menit dan iradiasi 800 Gy darah didiamkan selama 24 jam
kemudian diperoleh serum berwarna bening pada lapisan atas, serum
kemudian diambil dengan mikropipet dan dipindahkan kedalam mikrotube, serum dapat disimpan pada refrigerator.
4.4.10 Penghitungan Jumlah Sel Darah Merah
Sebanyak 2 µ L darah diambil melalui ekor hewan uji dan dilarutkan pada mikrotub yang berisi 198 µL larutan Hayem. Pengambilan darah
diambil setiap hari sampai dua minggu. Sel darah yang telah diambil diencerkan dengan NaCl 800µ L selanjutnya di periksa di bawah mikroskop
menggunakan kamar hitung Neubauer. Jumlah sel darah dihitung berdasarkan rumus yang tertera pada alat penghitung jumlah sel darah pada
produk Blau Brand Germany Improve Neubauer. Rumus menghitung jumlah sel darah merah:
Σ sel X FP =..........selmm
3
0,0025 mm
2
X 0,1 mm
4.4.11 Penghitungan Jumlah Sel Darah Putih
Sebanyak 2 µL darah diambil melalui ekor hewan uji dan dilarutkan pada mikrotub yang berisi 98 µL larutan Turk. Darah di ambil melalui ekor
karena untuk meminimalisir kontaminasi dari luar yang akan menyerang atau yang akan mengakibatkan penyakit pada mencit. Pengambilan darah
diambil setiap hari sampai dua minggu. Sel darah yang telah diambil diencerkan dengan NaCl 800µ L selanjutnya diperiksa dibawah mikroskop
menggunakan kamar hitung Neubauer. Jumlah sel darah dihitung berdasarkan rumus yang tertera pada alat penghitung jumlah sel darah
produk Blau Brand Germany Improve Neubauer.
Rumus menghitung jumlah sel darah putih: Σ sel X FP
=..........selmm
3
0,01 mm
2
X 0,1mm
4.4.12 Pengamatan Kondisi Fisik
Diamati kondisi fisik berat badan, mata, rambut, hidung dan aktifitas gerak pada mencit setiap harinya selama 2 minggu sebelum, saat
perlakuan dan setelah perlakuan. 4.4.13 Pengukuran Protein Serum Darah Mencit
Serum darah mencit yang diambil setelah vaksinasi selama 0, 6, 24, 48 jam serta serum darah mencit yang diambil setelah dilakukan uji
tantang, kemudian diukur kandungan proteinnya. Jumlah protein total didapatkan dengan cara
s
ebanyak 1 ml serum dalam aseton 1 : 9 dan disonikasi selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 5 ml larutan Lowry I
dan dibiarkan selama 10 menit. Selanjutnya ditambahkan 0,5 ml larutan Lowry II dan dibiarkan selama 30 menit. Absorban dibaca dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 750 nm.
4.4.14 Karakteristik Profil protein bakteri Klebsiella pneumoniae
Kategori