9. Uji tantang setelah 7 hari dengan infeksi K. pneumoniae aktif pada
mencit yang telah divaksinasi dengan kultur inaktivasi. 10.
Pengambilan serum darah mencit pada 0, 6, 24, 48, jam setelah uji tantang.
11. Pengukuran kadar protein serum K. pneumoniae dengan metode
Lowry 12.
Penghitungan dan analisa sel darah merah 13.
Penghitungan dan analisa sel darah putih 14.
Karakterisasi profil protein serum darah mencit dengan SDS PAGE. 15.
Analisa Statistik
4.4. PROSEDUR PENELITIAN 4.4.1 Pembuatan Medium TSB
Ditimbang 18 gr medium TSB lalu dimasukkan ke dalam erlemeyer 500 ml, dilarutkan dengan ditambahkan aquadest sebanyak 200 ml,
kemudian di homogenkan menggunakan magnetic stirrer di atas alat pemanas. Kemudian ditambahkan dengan aquadest sampai 500 ml lalu
disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit.
4.4.2 Pembuatan Medium TSA
Ditimbang 12 gr medium TSA lalu dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 500 ml, dilarutkan dengan ditambahkan aquadest sebanyak
300 ml dan agar sebanyak 15 gr, kemudian di homogenkan menggunakan magnetic strirrer di atas alat pemanas dan disterilisasi dalam autoklaf pada
suhu 121
o
C selama 15 menit. Setelah itu dimasukkan ke dalam cawan petri dan ditunggu sampai agarnya membeku.
4.4.3 Inaktivasi K. pneumoniae dengan Pemanasan
Sebanyak 30 ml kultur pada fase mid log disentrifugasi pada suhu 4
C selama 10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm dan dibilas dua kali dengan NaCl 0,85. Pelet yang diperoleh diencerkan hingga jumlah sel
10
12
selml dan ditempatkan pada tabung eppendorf sebanyak 4 ml. Kultur kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 65
C selama 30 menit. Kultur hasil pemanasan selanjutnya di uji viabilitasnya dalam
medium TSA. Bila tidak ada pertumbuhan koloni maka kultur dapat digunakan untuk percobaan selanjutnya.
4.4.4 Iradiasi Klebsiella pneumoniae dengan Sinar Gamma
Kultur pada fase mid log disentrifugasi 10.000 rpm dan dibilas dengan larutan NaCl 0,85 40 ml sebanyak 2 kali. Pelet yang diperoleh
diencerkan hingga diperoleh jumlah sel 10
8
selml dan ditempatkan di dalam vial gelas sebanyak 10 ml. Selanjutnya diiradiasi gamma dengan
dosis 800 Gy di Iradiator Gamma Chamber 4.000 A dengan laju dosis 1089,59 Gyjam. Kultur hasil iradiasi kemudian dihitung jumlah selnya
dengan metode sebar untuk uji inaktivasi dengan cara menanam kembali kultur hasil iradiasi pada medium TSA. Selanjutnya diinkubasi pada suhu
kamar selama 1 hari. Dari hasil yang diperoleh, didapatkan dosis inaktif kultur bakteri Klebsiella pneumoniae hasil iradiasi dengan cara melihat
pertumbuhan bakteri Klebsiella pneumoniae pada medium TSA Sugoro, 2004
.
4.4.5 Persiapan Hewan Uji
