4.2.2 Bahan penelitian
Bahan yang digunakan adalah strain bakteri Klebsiella pneumoniae K3 hasil isolasi dari susu sapi perah yang terinfeksi mastitis di Kabupaten
Garut, yang resisten terhadap antibiotik, larutan Turk Hayem, larutan NaCl fisiologis 0,85, medium Triptose Soy Broth TSB Pronadisa,
medium Triptic Soy Agar TSA Pronadisa, alkohol 95, aquadest steril, aseton, NaCl 0,85, larutan Lowry I Na
2
CO
3
4,9 ml dalam NaOH 0,1 N, larutan Lowry II Folin dan aquadest 1: 1, standar BSA, buffer Laemmli,
gel poliakrilamid 10 , pewarna Coommassie R-250 dan 32 mencit Mus musculus galur Swiss yang diperoleh dari Departemen Kesehatan RI.
4.3. TAHAPAN PENELITIAN
1. Sterilisasi alat, bahan dan media
2. Pembuatan media
3. Inaktivasi bakteri K. pneumoniae dengan pemanasan 65
C selama 30 menit
4. Inaktivasi bakteri K. pneumoniae dengan iradiasi sinar gamma 800 Gy
5. Injeksi bakteri K. pneumoniae aktif dan kultur hasil inaktivasi
6. Memperhatikan kondisi fisik mencit sebelum vaksinasi
7. Memperhatikan kondisi fisik mencit setelah vaksinasi
8. Pengambilan serum darah mencit pada 0, 6, 24, 48, jam setelah injeksi
K. pneumoniae aktif, K. pneumoniae hasil inaktivasi dengan pemanasan, dan K. pneumoniae hasil inaktivasi iradiasi.
9. Uji tantang setelah 7 hari dengan infeksi K. pneumoniae aktif pada
mencit yang telah divaksinasi dengan kultur inaktivasi. 10.
Pengambilan serum darah mencit pada 0, 6, 24, 48, jam setelah uji tantang.
11. Pengukuran kadar protein serum K. pneumoniae dengan metode
Lowry 12.
Penghitungan dan analisa sel darah merah 13.
Penghitungan dan analisa sel darah putih 14.
Karakterisasi profil protein serum darah mencit dengan SDS PAGE. 15.
Analisa Statistik
4.4. PROSEDUR PENELITIAN 4.4.1 Pembuatan Medium TSB
Ditimbang 18 gr medium TSB lalu dimasukkan ke dalam erlemeyer 500 ml, dilarutkan dengan ditambahkan aquadest sebanyak 200 ml,
kemudian di homogenkan menggunakan magnetic stirrer di atas alat pemanas. Kemudian ditambahkan dengan aquadest sampai 500 ml lalu
disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit.
4.4.2 Pembuatan Medium TSA
Ditimbang 12 gr medium TSA lalu dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 500 ml, dilarutkan dengan ditambahkan aquadest sebanyak
300 ml dan agar sebanyak 15 gr, kemudian di homogenkan menggunakan magnetic strirrer di atas alat pemanas dan disterilisasi dalam autoklaf pada
suhu 121
o
C selama 15 menit. Setelah itu dimasukkan ke dalam cawan petri dan ditunggu sampai agarnya membeku.
4.4.3 Inaktivasi K. pneumoniae dengan Pemanasan
Sebanyak 30 ml kultur pada fase mid log disentrifugasi pada suhu 4
C selama 10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm dan dibilas dua kali dengan NaCl 0,85. Pelet yang diperoleh diencerkan hingga jumlah sel
10
12
selml dan ditempatkan pada tabung eppendorf sebanyak 4 ml. Kultur kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 65
C selama 30 menit. Kultur hasil pemanasan selanjutnya di uji viabilitasnya dalam
medium TSA. Bila tidak ada pertumbuhan koloni maka kultur dapat digunakan untuk percobaan selanjutnya.
4.4.4 Iradiasi Klebsiella pneumoniae dengan Sinar Gamma
Kultur pada fase mid log disentrifugasi 10.000 rpm dan dibilas dengan larutan NaCl 0,85 40 ml sebanyak 2 kali. Pelet yang diperoleh
diencerkan hingga diperoleh jumlah sel 10
8
selml dan ditempatkan di dalam vial gelas sebanyak 10 ml. Selanjutnya diiradiasi gamma dengan
dosis 800 Gy di Iradiator Gamma Chamber 4.000 A dengan laju dosis 1089,59 Gyjam. Kultur hasil iradiasi kemudian dihitung jumlah selnya
dengan metode sebar untuk uji inaktivasi dengan cara menanam kembali kultur hasil iradiasi pada medium TSA. Selanjutnya diinkubasi pada suhu
kamar selama 1 hari. Dari hasil yang diperoleh, didapatkan dosis inaktif kultur bakteri Klebsiella pneumoniae hasil iradiasi dengan cara melihat
pertumbuhan bakteri Klebsiella pneumoniae pada medium TSA Sugoro, 2004
.
4.4.5 Persiapan Hewan Uji
Mencit yang digunakan adalah mencit betina dengan galur Swiss sebanyak 32 ekor yang dibagi ke dalam 4 kelompok percobaan, yaitu
masing-masing 8 ekor untuk kontrol normal dan kontrol negatif, dan masing-masing 8 ekor untuk inaktivasi K. pneumoniae pemanasan 65
C selama 30 menit dan inaktivasi iradiasi. Sebelum diberikan perlakuan
dilakukan pengamatan kondisi fisik dan penghitungan jumlah sel darah merah dan jumlah sel darah putih selama 3 hari. Usia mencit yang
digunakan seragam antara 2 atau 3 bulan. Dalam satu kandang terdapat 4 ekor mencit dengan jenis dan jumlah makanan yang sama. Rumus Federer
digunakan untuk menentukan jumlah hewan coba yang diperlukan untuk satu perlakuan.
n - 1 t - 1 15 t = Jumlah perlakuan
n = Jumlah ulangan dari tiap perlakuan n - 1 t - 1 15
n - 1 4 - 1 15 n - 1 3
15 3n - 3 15
3 n 8
n 6 Jadi jumlah hewan yang di pakai setiap perlakuan 6 ekor.
4.4.6 Uji In Vivo
Uji bahan vaksin terhadap mencit dilakukan dengan 4 perlakuan, yaitu kontrol normal, kontrol negatif, kultur inaktivasi dengan pemanasan
65 C selama 30 menit dan kultur inaktivasi dengan iradiasi. Pada kontrol
negatif, mencit di infeksikan atau disuntik dengan K. pneumoniae aktif, sedangkan pada kontrol negatif, mencit disuntikkan dengan NaCl 0,85.
Pada perlakuan pemanasan dan iradiasi kultur hasil inaktivasi iradiasi disuntikkan pada mencit.
4.4.7 Uji Tantang
Setelah 7 hari dari infeksi, mencit pada perlakuan pemanasan 65 C
selama 30 menit dan iradiasi 800 Gy ditantang dengan cara menyuntikkan isolat K. pneumoniae aktif pada mencit secara intraperitonial lalu dilihat
profil protein pada selang waktu 0, 6, 24, 48 jam, untuk mengetahui respon imunitasnya.
4.4.8 Pengamatan Persentasi Mortalitas
Diamati persentase mortalitas yang terjadi setiap hari selama dua minggu pengamatan.
Mortalitas = ∑ mencit mati X 100 =………
∑ mencit awal
4.4.9 Pengambilan Serum Darah
Diambil darah melalui jantung mencit sebanyak 2 ml pada masing- masing perlakuan kontrol normal, kontrol negatif, pemanasan 65
C selama 30 menit dan iradiasi 800 Gy darah didiamkan selama 24 jam
kemudian diperoleh serum berwarna bening pada lapisan atas, serum
kemudian diambil dengan mikropipet dan dipindahkan kedalam mikrotube, serum dapat disimpan pada refrigerator.
4.4.10 Penghitungan Jumlah Sel Darah Merah
Sebanyak 2 µ L darah diambil melalui ekor hewan uji dan dilarutkan pada mikrotub yang berisi 198 µL larutan Hayem. Pengambilan darah
diambil setiap hari sampai dua minggu. Sel darah yang telah diambil diencerkan dengan NaCl 800µ L selanjutnya di periksa di bawah mikroskop
menggunakan kamar hitung Neubauer. Jumlah sel darah dihitung berdasarkan rumus yang tertera pada alat penghitung jumlah sel darah pada
produk Blau Brand Germany Improve Neubauer. Rumus menghitung jumlah sel darah merah:
Σ sel X FP =..........selmm
3
0,0025 mm
2
X 0,1 mm
4.4.11 Penghitungan Jumlah Sel Darah Putih
Sebanyak 2 µL darah diambil melalui ekor hewan uji dan dilarutkan pada mikrotub yang berisi 98 µL larutan Turk. Darah di ambil melalui ekor
karena untuk meminimalisir kontaminasi dari luar yang akan menyerang atau yang akan mengakibatkan penyakit pada mencit. Pengambilan darah
diambil setiap hari sampai dua minggu. Sel darah yang telah diambil diencerkan dengan NaCl 800µ L selanjutnya diperiksa dibawah mikroskop
menggunakan kamar hitung Neubauer. Jumlah sel darah dihitung berdasarkan rumus yang tertera pada alat penghitung jumlah sel darah
produk Blau Brand Germany Improve Neubauer.
Rumus menghitung jumlah sel darah putih: Σ sel X FP
=..........selmm
3
0,01 mm
2
X 0,1mm
4.4.12 Pengamatan Kondisi Fisik
Diamati kondisi fisik berat badan, mata, rambut, hidung dan aktifitas gerak pada mencit setiap harinya selama 2 minggu sebelum, saat
perlakuan dan setelah perlakuan. 4.4.13 Pengukuran Protein Serum Darah Mencit
Serum darah mencit yang diambil setelah vaksinasi selama 0, 6, 24, 48 jam serta serum darah mencit yang diambil setelah dilakukan uji
tantang, kemudian diukur kandungan proteinnya. Jumlah protein total didapatkan dengan cara
s
ebanyak 1 ml serum dalam aseton 1 : 9 dan disonikasi selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 5 ml larutan Lowry I
dan dibiarkan selama 10 menit. Selanjutnya ditambahkan 0,5 ml larutan Lowry II dan dibiarkan selama 30 menit. Absorban dibaca dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 750 nm.
4.4.14 Karakteristik Profil protein bakteri Klebsiella pneumoniae
Pada penelitian ini, profil protein dianalisis dengan menggunakan metode elektroforesis satu dimensi SDS-PAGE dengan sistem buffer
Laemmli dan konsentrasi gel poliakrilamida yang digunakan 10. Kultur hasil iradiasi sinar gamma dan kultur hasil pemanasan diambil sebanyak 20
ul dengan mikropipet ke dalam tabung eppendorf, ditambahkan aseton
sebanyak 20 ul dan disonikasi hingga homogen, kemudian didihkan selama kurang 5 lebih menit.
1. Preparat Gel Elektroforesis
A. Separating gel 10
3 Acrylamide solution 6 ml ditambahkan separating gel buffer 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 sebanyak 4,5 ml, kemudian aquabidest 7,5 ml
dan 10 Ammonium persulfate 0,08 ml serta TEMED 0,01 ml B.
Stacking gel 4,5 3 Acrilamide solution 0,9 ml ditambahkan stacking gel buffer 0,5 M
Tris-HCl, pH 6,8 sebanyak 1,5 ml, kemudian aquabidest 3,6 ml dan 10 Ammonium persulfate 0,02 ml serta TEMED 0,01 ml.
2. Pembuatan Kolom Gel
Setelah separating gel dibuat kemudian dimasukkan sedikit demi sedikit kedaam alat elektroforesis dengan perlahan-lahan, lalu
ditambahkan aquabides untuk meratakan separating gel tersebut. Setelah separating gel membeku dimasukkan stacking gel sedikit demi
sedikit, lalu pasang sisir pembentuk kolom biarkan hingga stacking gel membeku lalu angkat sisirnya. Kemudian dipasang hasil gel tersebut
pada perangkat elektroforesis. A.
Loading sampel Larutan buffer dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis. Kemudian
sampel sebanyak 10 ul dimasukkan ke dalam kolom gel dengan hati- hati lalu dielektroforesis selama kurang lebih 100 menit pada 200
volt, 4 mA.
B. Pewarnaan Gel
Gel diangkat lalu diwarnai dengan coommassie brilliant blue R-250 staining solution, selama kurang lebih 1 jam.
C. Pencucian gel
Gel dicuci dengan larutan destain solution coommassie blue R-250, selama kurang lebih 24 jam.
D. Gel di Scan
Pita-pita yang terbentuk kemudian dianalisis bobot molekulnya.
4.6 ANALISA DATA
Untuk menganalisis data hasil elektroforesis SDS PAGE, gel discan, dihitung bobot molekulnya, kemudian dianalisa pita profil proteinnya.
Untuk analisis data statistik digunakan Analisis Varian Anova satu arah, dengan parameter kadar protein, sel darah merah, sel darah putih dan profil
protein, selanjutnya dilakukan analisis lanjutan Metode Duncan. Analisis dengan
SPSS v.16 untuk mengetahui apakah ada perbedaan atau pengaruh yang signifikan pada tiap perlakuan.
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1 HASIL PENELITIAN 5.1.1 Persentase Mortalitas
Hasil persentase mortalitas mencit pada setiap perlakuan dapat dilihat pada tabel 3.
Tabel 3. Persentase Mortalitas Mencit Dari data diatas mortalitas atau kematian pada mencit tidak ditemukan
pada perlakuan iradiasi 800 Gy, pemanasan 65 C selama 30 menit dan
kontrol normal, tetapi pada perlakuan kontrol negatif kematian mencit mencapai 100 setelah 24 jam infeksi K. pneumoniae aktif.
56 Mortalitas
Waktu Kontrol Negatif
Kontrol Normal
Vaksinasi Iradiasi
Uji Tantang
Pemanasan Vaksinasi
Iradiasi Uji
Tantang Iradiasi
6 jam 24 jam
100 48 jam
-