Gel Poliakrilamid SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS-PAGE

dilakukan elektroforesis pada gel poliakrilamida, dalam bentuk lempeng tegak lurus. Arah elektroforesis dari atas ke bawah. Setelah terjadi pemisahan, protein dalam gel dapat diperlihatkan setelah diwarnai dengan Coommassie blue, yang akan terlihat sebagai pita-pita Stryer, 2002. Protein kecil bergerak cepat dalam gel, sedangkan protein besar tinggal di atas, berdekatan dengan titik aplikasi campuran. Pergerakan sebagian rantai polipeptida pada kondisi seperti ini berbanding lurus dengan logaritma massanya. Elektroforesis SDS-gel poliakrilamid bersifat cepat, peka dengan kemampuan resolusi yang tinggi. Proses elektroforesis dan pewarnaan berlangsung beberapa jam. Sejumlah 0,1 mikrogram 2 pmol protein menghasilkan pita yang jelas dengan pewarnaan coommassie blue dan dalam jumlah lebih sedikit kira-kira 0,02 mikrogram dapat dideteksi dengan pewarnaan perak Stryer, 2002.

2.8.1 Gel Poliakrilamid

Akrilamid merupakan suatu monomer, yang jika ada radikal bebas, biasanya diberikan oleh amonium persulfat dan distabilkan oleh TEMED, terjadi reaksi berantai sehingga monomer terpolimerasi manjadi rantai panjang. Jika dalam reaksi itu ada bisakrilamid reaksi menjadi bersambung melintang menjadi gel yang pori-porinya ditentukan oleh panjang rantai dan jumlah sambungan silang. Panjang rantai ini ditentukan oleh konsentrasi poliakrilamid dalam reaksi ini 3,5 - 20 dan satu molekul sambungan silang terjadi pada setiap 29 monomer akrilamid Stryer, 2002. Gambar 5. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis Sudjadi, 2008 Gel poliakrilamid dibuat dengan cara menuangkan antara dua lempeng kaca yang dipisahkan dengan pembatas dengan ketebalan tertentu. Gel poliakrilamid dapat berukuran dari 5 cm samapai 50 cm panjangnya tergantung pada keperluannya dan dilakukan elektroforesis dengan cara vertikal. Sistem ini menunjukkan tiga keunggulan daripada gel agarosa : 1. Kekuatan pemisahannya sangat besar sehingga dapat memisahkan satu pasang basa sampai 500 pasang basa 2. Sistem ini dapat menampung jumlah sample lebih besar daripada agarosa 3. DNA yang diperoleh kembali dari gel poliakrilamid sangat murni sehingga dapat digunakan untuk keperluan percobaan mikroinjeksi embrio tikus Yuwono, 2008.

2.8.2 SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS-PAGE

Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran massanya dengan elektroforesis gel poliakrilamid dengan sistem tegak. Sebelumnya campuran protein dipanasi dengan natrium dedosil sulfat SDS, suatu detergen anionik untuk menyelubungi molekul protein. Penyelubungan ini menyebabkan interaksi non-kovalen terganggu sehingga molekul protein dalam struktur primer. Anion SDS berikatan dengan rantai utama dengan rasio satu molekul SDS untuk dua residu asam amino Sudjadi, 2008. Gambar 6. Prinsip Kerja SDS PAGE Stryer, 2002 1Denaturasi sample dengan sodium dedocylsulfate SDS menyelubungi protein. 2 Penempatan protein sampel pada gel kemudian dialiri listrik. 3 Pewarnaan untuk visualisasi pemisahan pita. Sistem dapar yang umumnya digunakan pada elektroforesis protein dengan gel poliakrilamid-SDS adalah sistem dapar diskontinu. Sistem ini menggunakan ion dapar yang berbeda dalam gel dan larutan dapar elektroda. Keunggulan sistem ini adalah pemisahan protein berlangsung lebih baik dan lebih tajam. Gel yang digunakan pada sitem ini terdiri dari gel penumpuk stacking gel yang berpori besar dan gel pemisah separating resolving gel yang berpori kecil. Gel penumpuk berada di atas gel pemisah dan separating resolving gel yang berpori kecil. Sedangkan sampel diletakkan diatas gel penumpuk. Molekul sampel yang melewati gel penumpuk dengan cepat akan bertumpuk dalam suatu zona yang sangat sempit stacks. Sampel yang tertumpuk itu akan bergerak sepanjang gel penumpuk yang berpori besar dan kemudian masuk ke gel pemisah berpori kecil sebagai suatu pita yang tipis setelah memasuki gel pemisah, molekul sampel terpisah berdasarkan muatan dan ukuran Yuwono, 2008. Untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekul dapat dilakukan dengan menambahkan suatu detergen ionik pada tahap denaturasi. Pada proses persiapan sampel ditambahkan suatu detergen ionik seperti sodium dodesil sulfat SDS. SDS akan menghilangkan konformasi di antara protein-protein tersebut dengan cara memberi muatan negatif. Agar seluruh rantai terpapar pada detergen dilakukan pemanasan pada suhu 100 C selama 2 sampai 5 menit, dengan cara ini sebagian besar polipeptida akan diselubungi oleh SDS dengan rasio tertentu 1,4 gr per gram protein. Kompleks SDS-polipeptida berbentuk seperti batang dan bermuatan negatif, dan muatan ini tidak dipengaruhi oleh pH pada kisaran pH 7-10. Dengan demikian, migrasi polipeptida dalam gel poliakrilamid adalah berdasarkan berat molekulnya. Kecepatan migrasi protein selama elektroforesis akan berbanding terbalik dengan berat molekulnya. Makin besar molekul makin lambat migrasinya Sudjadi, 2008. Gel poliakrilamid dibentuk oleh polimerisasi akrilamid CH 2 =CH- CO-NH 2 dan bisakrilamid N,N’-metilenbisakrilamid CH 2 =CH-CO-NH- CH 2 -NH-CO-CH=CH 2 . Reaksi pembentukan polimer ini diawali suatu sistem yang menghasilkan radikal bebas. Umumnya, polimerisasi diawali dengan menambahkan amonium persulfat APS, sebagai inisiator dan tetraetilendiamin TEMED, sebagai akselerator. Pada sistem ini TEMED mempercepat pemecahan molekul APS menjadi sulfat radikal bebas, yang selanjutnya akan mengawali reaksi polimerisasi akrilamid yang panjang, yang menghasilkan larutan kental namun bukan berupa gel. Dengan penambahan bisakrilamid, pada rantai akrilamid tersebut akan terbentuk ikatan lintas silang cross-link pada interval tertentu sehingga terbentuk suatu jaringan dengan besar pori tertentu. Konsentrasi akrilamid menentukan ukuran pori-pori gel yang terbentuk sehingga ukuran pori dapat diatur dengan mengatur konsentrasi akrilamid. Makin rendah konsentrasi akrilamid yang digunakan, makin besar ukuran pori-pori gel, namun gel menjadi lunak dan mudah patah. Merkaptoetanol atau ditiotreitol juga ditambahkan untuk mereduksi ikatan disulfida. Kompleks SDS dengan protein terdenaturasi mempunyai jumlah muatan negatif yang sebanding dengan ukuran protein. Muatan negatif yang terdapat pada ikatan SDS ini jauh lebih besar daripada mutan pada protein asli. Kompleks protein-SDS kemudian dielektroforesis sehingga semua molekul bergerak menuju kutub positif. Ketika elektroforesis selesai, protein dalam gel dapat ditampakkan oleh pewarnaan dengan perak atau zat warna seperti Coommassie blue, yang akan menampakkan beberapa pita. Coommassie blue berikatan dengan protein berdasarkan interaksi ionik antara gugus sulfit pada Coommassie blue dengan asam-asam amino basa, dan interaksi hidrofobik cincin Coommassie blue Stryer, 2002. Pewarna mampu menghasilkan pita pada jumlah protein 10-100 ng. Protein kecil akan bergerak cepat melewati gel, sedangkan protein besar bergerak lebih lambat. Mobilitas kebanyakan polipetida di bawah kondisi seperti ini berbanding lurus terhadap log ukurannya. Beberapa protein yang banyak mengandung karbohidrat dan protein membran tidak mengikuti aturan ini. Akan tetapi metode SDS-PAGE ini sangat cepat, peka dan dapat menghasilkan pemisahan yang baik. Sebanyak sekitar 0,1 mg 2 pmol protein menghasilkan pita yang jelas dengan pewarna Coommassie blue. Pada jumlah yang kecil 0,02 mg dapat dideteksi dengan pewarna perak. Protein dengan perbedaan ukuran seitar 2 misalnya 40 dan 41 kD biasanya dapat ditunjukan Sudjadi, 2008. 45

BAB III KERANGKA KONSEP

Gambar 7. Bagan Kerangka Konsep Kendala peningkatan produksi ternak Mastitits Coliform K. pneumoniae Antibiotik Vaksin Pengobatan Alternatif  Kurang efektif  Resisten antibakteri  Biaya mahal Uji In vivo Inaktivasi Pemanasan Analisa profil protein Terbentuk sistem imunitas Inaktivasi Iradiasi Elektroforesis SDS PAGE Analisa Kadar Protein Analisa Kondisi Fisik, SDM, SDP