E. Tatacara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman jambu mete dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Pengumpulan buah jambu mete
Buah jambu mete yang sudah masak dikumpulkan dari tanaman jambu mete yang tumbuh di kawasan Desa Wisata Karangtengah, Mojolegi, Imogiri,
Bantul, Daerah Istimewa Yogyakarta. Buah dipanen pada awal bulan November 2014. Pemanenan dilakukan pada pagi hari.
3. Preparasi buah jambu mete
Buah jambu mete dicuci menggunakan air mengalir. Buah jambu mete yang telah dicuci kemudian dipotong tipis
– tipis menggunakan pisau stainless steel. Buah jambu mete yang telah dipotong selanjutnya ditimbang kemudian
ditata di atas tampah. Buah jambu mete selanjutnya dikeringkan dibawah sinar matahari pada pagi hari pukul 08.00
– 11.00 dan sore hari pukul 15.00 – 17.00 dengan ditutup kain hitam. Pengeringan dilakukan hingga potongan buah mudah
dipatahkan. Hasil pengeringan kemudian diblender dan diayak menggunakan ayakan 40 mess. Serbuk hasil pengayakan kemudian ditimbang.
Serbuk buah jambu mete ditimbang sebanyak 100 g, masukkan dalam Erlenmeyer 500 mL, etanol 70 ditambahkan ke dalam Erlenmeyer hingga
semua bagian serbuk buah jambu terendam seluruhnya. Penambahan etanol dilebihkan hingga lebih kurang 2 cm diatas permukaan serbuk buah jambu mete.
Erlenmeyer ditutup menggunakan alumunium foil. Proses maserasi dilakukan
dengan penggojogan selama 24 jam menggunakan orbital shaker pada suhu ruang. Hasil dari proses maserasi disaring menggunakan kertas saring dengan
bantuan corong Buchner dan pompa vakum. Filtrat kemudian disimpan dalam kondisi penyimpanan yang sesuai. Ampas dari proses penyaringan kemudian
dimaserasi kembali selama 24 jam. Proses maserasi dan penyaringan ini dilakukan sebanyak tiga kali. Dilakukan replikasi sebanyak tiga kali.
Semua filtrat yang diperoleh kemudian disatukan dalam labu alas bulat dan dipekatkan menggunakan vaccum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak
etanol kental buah jambu mete. Setelah dipekatkan ekstrak kental ini kemudian dipanaskan pada waterbath hingga bebas penyari. Ekstrak kental ini kemudian
difraksinasi menggunakan metode ekstraksi cair – cair. Ekstrak kental dilarutkan
dalam akuades hangat, kemudian difraksinasi menggunakan etil asetat dengan perbandingan akuades : etil asetat 1:1 vv didalam corong pisah. Terbentuk dua
lapisan, yaitu lapisan air dan lapisan etil asetat. Lapisan etil asetat bagian atas kemudian diambil dan ditampung dalam wadah. Lapisan air bagian bawah
difraksinasi kembali menggunakan etil asetat dengan perbandingan yang sama. Tahapan ini diulang hingga tiga kali. Fraksi etil asetat kemudian dipekatkan
menggunakan vaccum rotary evaporator. Fraksi etil asetat pekat kemudian dikeringkan menggunakan waterbath. Fraksi etil asetat yang diperoleh kemudian
disimpan dalam desikator.
4. Penetapan kandungan fenolik total
a. Pembuatan larutan asam galat Asam galat ditimbang sebanyak 10 mg, kemudian dimasukkan ke
dalam gelas Beker dan dilarutkan dengan aquades : metanol p.a 1:1. Larutan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, tambahkan akuades :
metanol p.a 1:1 sampai batas tanda. Larutan tersebut diambil sebanyak 0,4; 0,5 ; 0,6 ; 0,7 ; dan 0,8 mL, masukkan ke dalam labu takar 10 mL dan
tambahkan aquades : metanol p.a 1:1 sampai batas tanda, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 40; 50; 60; 70; dan 80
μg mL. b. Pembuatan larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total
Fraksi etil asetat ditimbang sebanyak 10 mg, larutkan menggunakan aquades : metanol p.a 1:1 dalam gelas beker. Kemudian masukkan ke
dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan aquades : metanol p.a 1:1 hingga batas tanda. Larutan diambil 2,0 mL, masukkan ke dalam labu takar
10 mL dan ditambahkan aquades : metanol p.a 1:1 hingga batas tanda. Konsentrasi larutan uji sebesar 2
00,0 μg mL. c. Penentuan operating time
Larutan asam galat dengan konsentrasi 40; 60; dan 8 0 μg mL
diambil sebanyak 0,5 mL. Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan sebanyak 2,0 mL pada masing
– masing larutan, diamkan selama 5 menit. Selanjutnya, ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Baca
absorbansi larutan setiap 5 menit dengan spektrofotometer visibel pada
panjang gelombang 750 nm selama 60 menit. Lakukan replikasi sebanyak 3 kali.
d. Penentuan panjang gelombang maksimum Larutan asam galat dengan konsentrasi 40; 60; dan 8
0 μg mL diambil sebanyak 0,5 mL. Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan sebanyak 2
mL pada masing – masing larutan, diamkan selama 5 menit. Selanjutnya,
ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Diamkan selama operating time yang telah didapat, kemudian dilakukan scanning panjang
gelombang maksimum dengan spektrofotometer visibel dengan panjang gelombang 600-800 nm.
e. Pembuatan kurva baku asam galat Larutan asam galat dengan konsentrasi 40; 50; 60; 70; dan 8
0 μg mL diambil sebanyak 0,5 mL. Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan
sebanyak 2 mL, diamkan selama 5 menit. Selanjutnya, ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M, diamkan selama operating time yang telah
didapat. Baca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh. Lakukan replikasi sebanyak 3 kali.
f. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji Larutan uji dengan konsentrasi 200,0 μgmL diambil sebanyak 0,5
mL. Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan sebanyak 2 mL, diamkan selama 5 menit. Selanjutnya, ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M,
diamkan selama operating time yang telah didapat. Baca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh.
5. Uji aktivitas antioksidan
a. Pembuatan larutan stok rutin Rutin ditimbang sebanyak 10 mg. Masukkan ke dalam gelas beker
dan larutkan dengan akuades hangat. Larutan dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL dan tambahkan akuades hingga batas tanda sehingga
diperoleh konsentrasi larutan stok rutin sebesar 100 μg mL.
b. Pembuatan larutan pembanding Larutan stok rutin diambil sebanyak 0,5; 1; 1,5; 2,0; 2,5 mL.
Masukkan ke dalam labu takar 10 mL dan tambahkan aquades sampai batas tanda, sehingga diperoleh konsentrasi larutan pembanding rutin
sebesar 5; 10; 15; 20; dan 25 μg mL.
c. Pembuatan Reagen Fenton 1. Larutan FeCl
3
1mM Ferri klorida heksahidrat ditimbang sebanyak 13,5 mg,
masukkan ke dalam gelas bekker dan larutkan dengan aquades secukupnya. Larutan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL,
kemudian tambahkan aquades hingga batas tanda. Ambil 2,0 mL larutan, masukkan ke dalam labu takar 10 mL, tambahkan aquades
hingga batas tanda. 2. Larutan EDTA 1mM
Serbuk EDTA ditimbang sebanyak 14,6 mg, masukkan ke dalam gelas beker dan larutkan menggunakan aquades. Larutan
dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, kemudian tambahkan aquades
hingga batas tanda. Ambil 2,0 mL larutan, masukkan ke dalam labu takar 10 mL, tambahkan aquades hingga batas tanda.
3. Larutan asam askorbat 1 mM Asam askorbat ditimbang sebanyak 17,6 mg, masukkan ke
dalam gelas beker dan larutkan menggunakan aquades. Larutan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, kemudian tambahkan aquades
hingga batas tanda. Ambil 1,0 mL larutan, masukkan ke dalam labu takar 10 mL, tambahkan aquades hingga batas tanda.
4. Larutan H
2
O
2
20 mM Sebanyak 0,078 mL larutan H
2
O
2
35 diambil, kemudian di masukkan ke dalam labu takar 10 mL dan tambahkan aquades hingga
batas tanda. Sebanyak 2,5 mL larutan tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL. Tambahkan aquades hingga batas tanda.
d. Pembuatan larutan Deoksiribosa 2,5 mM Deoksiribosa ditimbang sebanyak 20,9 mg, masukkan ke dalam
gelas beker dan larutkan menggunakan aquades. Larutan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL dan tambahkan aquades hingga batas tanda.
Ambil 4,0 mL larutan, masukkan ke dalam labu takar 25 mL. Tambahkan akuades hingga batas tanda.
e. Pembuatan larutan TCA 5 TCA ditimbang sebanyak 2,5 g, masukkan ke dalam gelas beker
dan larutkan menggunakan akuades. Larutan dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL dan tambahkan akuades hingga batas tanda.
f. Pembuatan larutan TBA 1 TBA ditimbang sebanyak 0,25 g, masukkan ke dalam gelas beker
dan larutkan menggunakan akuades secukupnya, proses pelarutan dilakukan di atas hot plate hingga seluruh TBA larut. Larutan dimasukkan
ke dalam labu takar 25 mL dan tambahkan akuades hingga batas tanda. g. Pembuatan larutan bufer fosfat
Na
2
HPO
4
ditimbang sebanyak 1,4196 g, masukkan ke dalam gelas beker dan larutkan menggunakan aquades. Larutan dimasukkan ke dalam
labu takar 500 mL, tambahkan aquades hingga batas tanda. Kemudian timbang sebanyak 0,6805 gram KH
2
PO
4
, masukkan ke dalam gelas beker dan larutkan menggunakan aquades. Larutan dimasukkan ke dalam labu
takar 250 mL dan tambahkan aquades hingga batas tanda. Masukkan larutan Na
2
HPO
4
secukupnya ke dalam gelas beker dan tambahkan larutan KH
2
PO
4
tetes demi tetes hingga pH larutan sebesar 7. h. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan
Fraksi etil asetat ditimbang sebanyak 50,0 mg, masukkan ke dalam gelas beker dan larutkan dengan akuades hangat. Larutan kemudian
dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL dan ditambahkan akuades sampai batas tanda. Larutan diambil sebanyak 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; dan 5,0 mL,
masukkan ke dalam labu takar 10 mL, kemuadian tambahkan akuades sampai batas tanda. Konsentrasi larutan uji yang diperoleh sebesar 100;
200; 300; 400; dan 500 μg mL.
i. Penentuan Operating time Sebanyak 300
μL larutan FeCl
3
1 mM, 300 μL larutan EDTA 1 mM, 300
μL larutan H
2
O
2
20 mM, 300; μL larutan deoksiribosa 2,5 mM,
4500 μL bufer fosfat dan 300 μL larutan asam askorbat 1 mM dimasukkan
pada tabung reaksi bertutup. Larutan dicampur menggunakan vortex selama lebih kurang 10 detik. Larutan kemudian diinkubasi selama 1 jam
pada suhu 37
o
C menggunakan oven. Setelah larutan diinkubasi, tambahkan 1 mL TCA 5 dan 1 mL TBA 1. Larutan dicampur menggunakan
vortex selama lebih kurang 10 detik. Larutan tersebut dipanaskan pada waterbath dengan suhu 80
o
C selama 30 menit. Dinginkan dengan bantuan air mengalir selama 5 menit. Baca absorbansinya setiap 5 menit pada
panjang gelombang maksimum teoritis 532 nm selama 1 jam. j. Penentuan panjang gelombang maksimum
Pada 3 tabung reaksi bertutup, masukkan sebanyak 300 μL larutan
FeCl
3
1 mM, 300 μL larutan EDTA 1 mM, 300 μL larutan H
2
O
2
20 mM, 200; 300; 400
μL larutan deoksiribosa 2,5 mM, 4600; 4500; 4400 μL bufer fosfat dan 300
μL larutan asam askorbat 1 mM pada masing – masing tabung reaksi. Larutan dicampur menggunakan vortex selama lebih kurang
10 detik. Larutan kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
o
C menggunakan oven. Setelah larutan diinkubasi, tambahkan 1 mL TCA 5
dan 1 mL TBA 1. Larutan dicampur menggunakan vortex selama lebih kurang 10 detik. Larutan tersebut dipanaskan pada waterbath dengan suhu
80
o
C selama 30 menit. Dinginkan dengan bantuan air mengalir selama 5
menit. Diamkan selama operating time yang telah didapat. Lakukan scanning pada panjang gelombang 400
– 600 nm. k. Pengujian aktivitas penangkapan radikal hidroksil
1. Kontrol negatif Sebanyak 300
μL larutan FeCl
3
1 mM, 300 μL larutan EDTA 1 mM, 300 μL larutan H
2
O
2
20 mM, 300 μL larutan deoksiribosa 2,5
mM, 1 mL akuades, 3500 μL bufer fosfat dan 300 μL larutan asam
askorbat 1 mM dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup. Larutan dicampur menggunakan vortex selama lebih kurang 10 detik. Larutan
kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
o
C menggunakan oven. Setelah larutan diinkubasi, tambahkan 1 mL TCA 5 dan 1 mL TBA
1. Larutan dicampur menggunakan vortex selama lebih kurang 10 detik. Larutan tersebut dipanaskan pada waterbath dengan suhu 80
o
C selama 30 menit. Dinginkan dengan bantuan air mengalir selama 5
menit. Diamkan selama operating time. Ukur serapan pada panjang gelombang maksimum yang telah ditetapkan sebelumnya.
2. Larutan pembanding rutin Pada 5 tabung reaksi bertutup, masukkan sebanyak 300
μL larutan FeCl
3
1 mM, 300 μL larutan EDTA 1 mM, 300 μL larutan H
2
O
2
20 mM, 300 μL larutan deoksiribosa 2,5 mM, 1 mL larutan pembanding
rutin dengan konsentrasi 5; 10; 15; 20; dan 25 μg mL, 3500 μL bufer
fosfat dan 300 μL larutan asam askorbat 1 mM pada masing – masing
tabung reaksi. Larutan dicampur menggunakan vortex selama lebih
kurang 10 detik. Larutan kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
o
C menggunakan oven. Setelah larutan diinkubasi, tambahkan 1 mL TCA 5 dan 1 mL TBA 1. Larutan dicampur menggunakan vortex
selama lebih kurang 10 detik. Larutan tersebut dipanaskan pada waterbath dengan suhu 80
o
C selama 30 menit. Dinginkan dengan bantuan air mengalir selama 5 menit. Diamkan selama operating time.
Ukur serapan pada panjang gelombang maksimum yang telah ditetapkan sebelumnya. Persen IC dihitung dari hasil absorbansi yang
diperoleh. Dibuat persamaan regresi linier antara konsentrasi larutan pembanding rutin vs IC untuk menentukan nilai IC
25
. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
3. Larutan uji Pada 5 tabung reaksi bertutup, di
masukkan sebanyak 300 μL larutan FeCl
3
1 mM, 300 μL larutan EDTA 1 mM, 300 μL larutan H
2
O
2
20 mM, 300 μL larutan deoksiribosa 2,5 mM, 1 mL larutan uji dengan konsentrasi 100; 200; 300; 400; dan 500
μg mL, 3500 μL bufer fosfat dan 300 μL larutan asam askorbat 1 mM pada masing – masing tabung
reaksi. Larutan dicampur menggunakan vortex selama lebih kurang 10 detik. Larutan kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
o
C menggunakan oven. Setelah larutan diinkubasi, tambahkan 1 mL TCA
5 dan 1 mL TBA 1. Larutan dicampur menggunakan vortex selama lebih kurang 10 detik. Larutan tersebut dipanaskan pada waterbath
dengan suhu 80
o
C selama 30 menit. Dinginkan dengan bantuan air
mengalir selama 5 menit. Diamkan selama operating time. Ukur serapan pada panjang gelombang maksimum yang telah ditetapkan
sebelumnya. Dari hasil absorbansi yang diperoleh, hitung IC dan dibuat persamaan regresi linier yang merupakan hubungan antara
konsentrasi larutan pembanding rutin vs IC untuk menentukan nilai IC
25
. Lakukan replikasi sebanyak 3 kali.
F. Analisis Data
Kategori