Gambar 6. Hasil uji kualitatif aktivitas antioksidan pada fraksi etil asetat buah jambu mete
Keterangan Gambar 6 : A = kontrol negatif tanpa penambahan senyawa antioksidan
B = kontrol positif rutin C = larutan uji fraksi etil asetat buah jambu mete
Hasil uji kualitatif fraksi etil asetat buah jambu mete menunjukkan hasil positif Gambar 6. Intensitas warna yang terbentuk pada sampel uji lebih
pudar apabila dibandingkan dengan kontrol negatif. Hal ini berarti fraksi etil asetat buah jambu mete memiliki aktivitas sebagai antioksidan.
E. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total
1. Penentuan Operating time
Penentuan operating time bertujuan untuk mendapatkan waktu dimana reaksi antara sampel dan pereaksi berada pada kondisi optimum. Keadaan reaksi
yang optimum ditunjukkan dengan nilai absorbansi yang relatif stabil. Pada saat awal terjadi reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna akan terus meningkat
hingga pada waktu tertentu akan diperoleh absorbansi yang stabil. Namun
A B
C
semakin lama waktu pengukuran, ada kemungkinan senyawa berwarna tersebut akan mengalami kerusakan sehingga menyebabkan intensitas warnanya menurun
dan absorbansinya juga menurun Gandjar dan Rohman, 2007.
Gambar 7. Grafik operating time replikasi 1 untuk penetapan fenolik total
Penentuan operating time pada metode Folin – Ciocalteu untuk
penetapan kandungan fenolik total ini dilakukan selama 60 menit. Setiap 5 menit absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang teoritis 750 nm. Absorbansi
yang diperoleh selama 60 menit kemudian dilihat pada waktu keberapa menghasilkan absorbansi yang cenderung stabil atau selisihnya kecil. Gambar 7
menunjukkan grafik operating time pada replikasi 1. Operating time yang didapat untuk penetapan kandungan fenolik total adalah 35 menit. Pada waktu tersebut
diperoleh nilai absorbansi yang stabil. 2.
Penentuan panjang gelombang maksimum
Penentuan panjang
gelombang maksimum
bertujuan untuk
mendapatkan nilai serapan maksimum dari hasil reaksi antara asam galat dengan
0,1 0,2
0,3 0,4
0,5 0,6
0,7 0,8
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
A b
sor b
an si
Waktu menit
Grafik Operating Time Untuk Penetapan Fenolik Total
40 μg mL 60 μg mL
80 μg mL
reagen Folin-Cioucalteu. Pengukuran suatu analit harus pada panjang gelombang maksimum karena pada panjang gelombang maksimum kepekaannya tinggi,
sehingga perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar Gandjar dan Rohman, 2007. Pada penentuan panjang gelombang
maksimum digunakan tiga tingkat konsentrasi yaitu rendah 40 µgmL, sedang 60 µgmL, dan tinggi 80 µgmL. Tujuan dilakukan scanning pada tiga tingkat
konsentrasi yang berbeda adalah untuk merepresentasikan panjang gelombang maksimum pada tiap konsentrasi. Pengukuran lambda maksimum dilakukan pada
rentang panjang gelombang antara 600
– 800 nm. Tabel I. Hasil scanning panjang gelombang maksimum untuk penentuan
fenolik total
Konsentrasi Larutan Asam
Galat Lambda
maksimum hasil scanning
Lambda maksimum yang
digunakan Lambda
maksimum teoritis
40 µgmL 739 nm
739 nm 750 nm
60 µgmL 739 nm
80 µgmL 738 nm
Panjang gelombang maksimum yang digunakan adalah 739 nm. Hasil
yang diperoleh dari hasil scanning panjang gelombang maksimum menunjukkan hasil yang berbeda dengan lambda maksimum teoritis Tabel I. Hal ini dapat
disebabkan oleh beberapa hal antara lain jenis pelarut, pH larutan, suhu, konsentrasi tinggi, dan zat
– zat pengganggu Gandjar dan Rohman, 2007. F.
Penetapan Kandungan Fenolik Total
Senyawa fenolik termasuk senyawa fenol sederhana, asam fenolat, tanin, flavonoid, lignan, dan lignin merupakan metabolit sekunder yang banyak
terkandung dalam tanaman. Senyawa ini memiliki peran antara lain sebagai pigmentasi, antioksidan, dan pelindung terhadap sinar ultraviolet Blainski et al.,
2013. Berdasarkan pada peran yang cukup penting maka keberadaan senyawa fenolik dalam suatu tanaman perlu untuk dikuantifikasi.
Banyak metode yang digunakan untuk mengkuantifikasi senyawa fenolik. Salah satu metode yang sering digunakan adalah kuantifikasi dengan
spektrofotometri. Reaksi kolorimetri banyak digunakan dalam metode spektrofotometri UVVIS. Metode ini akan mengukur konsentrasi senyawa
fenolik secara total dalam ekstrak tumbuhan. Pada prinsipnya, senyawa fenolik dalam ekstrak tumbuhan akan bereaksi dengan reagen redoks tertentu Folin
Ciocalteu-reagen untuk membentuk kompleks biru yang dapat diukur dengan cahaya tampak. Reaksi pembentukan kromofor biru didasari oleh kompleks
fosfotungstat-fosfomolibdat. Pada reaksi ini serapan yang dihasilkan bergantung pada larutan alkali dan konsentrasi senyawa fenolik Blainski et al., 2013.
Gambar 8. Struktur asam galat
Penetapan kandungan fenolik total dimulai dengan membuat kurva baku asam galat. Asam galat Gambar 8 digunakan sebagai standar kurva baku
karena asam galat merupakan senyawa polifenol yang dapat menggambarkan senyawa fenolik dalam suatu sampel. Pembuatan kurva baku ini dilakukan
sebanyak tiga kali replikasi. Kurva baku ini menghasilkan suatu persamaan regresi linier yang digunakan dalam menentukan jumlah kandungan fenolik total
dalam sampel. Tidak semua persamaan regresi linier digunakan dalam
menentukan kandungan fenolik total. Persamaan regresi dengan linieritas terbaik nilai R mendekati 1 akan digunakan untuk menentukan kandungan fenolik total.
Tabel II menunjukkan hasil pengukuran absorbansi kurva baku asam galat.
Tabel II. Hasil pengukuran absorbansi kurva baku asam galat.
Replikasi 1 Replikasi 2
Replikasi 3 Konsentrasi Absorbansi Konsentrasi Absorbansi Konsentrasi Absorbansi
40,4 μgmL 0,3108
40,8 μgmL
0,3674 40,4
μgmL 0,3093
50,5 μgmL 0,3931
51,0 μgmL
0,4404 50,5
μgmL 0,3889
60,6 μgmL 0,4652
61,2 μgmL
0,5026 60,6
μgmL 0,4553
70,7 μgmL 0,5665
71,4 μgmL
0,5731 70,7
μgmL 0,5253
80,8 μgmL 0,6459
81,6 μgmL
0,6559 80,8
μgmL 0,5916
y = 0,0084x – 0,0299
r = 0,9988 y = 0,007x + 0,0821
r = 0,9989 y = 0,0069x + 0,0335
r = 0,9994
Gambar 9. Kurva baku asam galat untuk penetapan kandungan fenolik total
Persamaan yang digunakan dalam menentukan kandungan fenolik total adalah persamaan regresi dari replikasi ketiga, yaitu y = 0,0069x + 0,0335 dengan
linieritas sebesar 0,9994. Nilai linieritas menunjukkan korelasi antara konsentrasi
y = 0.0069x + 0.0335 R = 0.9994
0,1 0,2
0,3 0,4
0,5 0,6
0,7
20 40
60 80
100
A b
sor b
an si
Konsentrasi μgmL
Grafik Kurva Baku Asam Galat
dan absorbansi yang dihasilkan. Semakin baik nilai linieritas nilai R sama dengan 1 atau mendekati 1 maka korelasi juga semakin baik.
Tabel III. Hasil penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat buah jambu mete
Konsentrasi Absorbansi Kandungan
fenolik total Rata -
rata CV
Replikasi 1 202
μgmL 0,4808
320,921 339,3 ±
13,1 3,8
Replikasi 2 202
μgmL 0,5219
350,409 Replikasi 3
204 μgmL
0,5165 346,535
Tabel III menunjukkan hasil pengukuran sampel uji untuk penentuan kandungan fenolik total. Absorbansi sampel yang diperoleh kemudian
dimasukkan ke dalam persamaan regresi linier yang telah didapatkan. Hasil perhitungan menunjukkan bahwa fraksi etil asetat buah jambu mete memiliki nilai
kandungan fenolik total sebesar 339,3 ± 13,1 mg ekivalen asam galat. Penelitian yang dilakukan oleh Adou et al. 2012 menyatakan kandungan senyawa fenolik
pada jus buah jambu mete sebesar 1653,8 ± 2.3 sampai 2374,2 ± 5.4 mg ekivalen asam galat. Apabila dibandingkan antara penelitian ini dengan penelitian yang
dilakukan oleh Adou et al. 2012, hasil senyawa fenolik pada penelitian ini tergolong rendah. Hal ini dikarenakan adanya proses oksidasi oleh enzim
polifenol oksidase saat proses pengeringan, sehingga menyebabkan kerusakan pada senyawa polofenol yang ada pada buah jambu mete.
G. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan
