26
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian toksisitas subakut infusa biji alpukat terhadap gambaran histopatologis ginjal tikus ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni
dengan rancangan sederhana, acak, lengkap dan pola searah.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel utama
Variabel utama penelitian ini terdari dari variabel bebas dan tergantung. a. Variabel bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah variasi dosis infusa biji alpukat P. americana Mill..
b. Variabel tergantung Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah perubahan histopatologi
organ ginjal akibat pemberian subakut infusa biji alpukat P. americana Mill. pada tikus galur Sprague Dawley.
2. Variabel pengacau
a. Variabel pengacau terkendali Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kondisi
hewan uji, yaitu tikus galur Sprague Dawley dengan berat badan 150-250
gram dan umur 2-3 bulan. Bahan uji yang digunakan, yaitu biji alpukat P. americana
Mill. yang mempunyai waktu panen, tempat tumbuh dan suhu yang sama. Frekuensi pemberian infusa satu kali sehari selama 28 hari
berturut-turut dengan waktu pemberian yang sama secara per oral. b. Variabel pengacau tak terkendali
Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah kondisi patologis dan fisiologis dari tikus galur Sprague Dawley yang digunakan
dalam penelitian.
C. Definisi Operasional
1. Dosis infusa biji alpukat P. americana Mill.
Dosis infusa biji alpukat didefinisikan sebagai volume mL infusa biji alpukat P. americana Mill. tiap kg berat badan subjek uji yang digunakan.
2. Infusa biji alpukat P. americanaMill.
Infusa serbuk kering biji alpukat P. americana Mill. didapatkan dari dengan menginfundasi 8,0 g serbuk kering biji alpukat P. americana Mill.
dalam 100,0 mL air pada suhu 90°C selama 15 menit, sehingga menghasilkan infusa biji alpukat dengan konsentrasi 8
b v
.
3. Pemberian subakut
Pemberian infusa biji alpukat P. americana Mill. satu kali sehari selama 28 hari secara per oral.
4. Sifat efek toksik
Sifat efek toksik yang mungkin adalah keterbalikan atau tak terbalikan.
5. Perubahan histopatologis
Perubahan histopatologis dilihat dari gambaran mikroskopis kelompok perlakuan yang dibandingkan terhadap kelompok kontrol.
D. Bahan Penelitian
1. Bahan Penelitian
a. Biji alpukat P. americana Mill. yang ambil selama bulan Juni dan diperoleh dari Depot Es Teller 77 yang berada di Galeria Mall Yogyakarta.
b. Hewan uji yang digunakan, yaiu tikus galur Sparague Dawley umur 2-3 bulan dan berat badan 150-250 gram diperoleh dari Laboratorium
Imunologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. c. Aquadest untuk asupan minum dan sebagai pelarut infusa. Pelet AD-2
untuk asupan pakan tikus. d. Bahan untuk pemeriksaan histologis yaitu formalin 10 yang dibuat
dengan mengencerkan formalin 30 dengan aquadest sesuai volume yang dikehendaki. Bahan untuk pemeriksaan histopalogis adalah formalin 10
yang dibuat dengan mengencerkan formalin 30 dengan aquadest sesuai volume yang dikehendaki.
E. Alat dan Instrumen Penelitian
1. Alat pembuatan simplisia
Mesin blender, timbangan digital, oven, blender, ayakan no. 40, dan wadah untuk menyimpan serbuk biji alpukat.
2. Alat penetapan kadar air
Alat Moisture Balance, sendok, dan stopwatch.
3. Alat pembuatan infusa
Panci lapis enamel, termometer, stopwatch, beaker glass, gelas ukur, batang pengaduk, kompor listrik, timbangan analitik, dan kain flannel.
4. Alat- alat untuk perlakuan dan pemeriksaan histologis
Kandang tikus metabolic cage, jarum suntik per ora, spuit injeksi, timbangan, seperangkat alat bedah, alat-alat gelas dan pot-pot untuk
menyimpan organ.
F. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi biji alpukat dilakukan di Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
2. Pengumpulan biji alpukat
Bahan uji pada penelitian ini yang digunakan adalah biji alpukat.Biji alpukat diperoleh dari salah satu Depot Es Teller 77 yang berada di Galeria Mall
Yogyakarta pada bulan Juni 2014.
3. Pembuatan serbuk biji alpukat
Biji alpukat dibersihkan dari kulit luarnya, dipotong tipis kemudian dikeringkan dengan dimasukkan kedalam oven yang sudah diatur suhunya, suhu
yang digunakan 50 C selama 72 jam. Potongan biji yang telah kering kemudian
diserbuk dan diayak dengan menggunakan ayakan no. 40.
4. Penetapan kadar air serbuk kering biji alpukat P. americana Mill.
Serbuk kering biji alpukat P. americana Mill. yang sudah terayak, dimasukkan ke dalam alat moisture balance ± 5 g kemudian diratakan, lalu akan
muncul kadar air.
5. Pembuatan infusa biji alpukat P. americana Mill.
Serbuk kering biji alpukat P. americana Mill. ditimbang sebanyak 8 g, kemudian serbuk dimasukkan dalam panci enamel dan dibasahi dengan aquadest
sebanyak dua kali berat serbuk. Sebanyak 100 mL pelarut aquadest ditambahkan ke dalam panci enamel berisi serbuk yang telah dibasahi tersebut. Pemanasan
dilakukan pada suhu 90°C dan dijaga tetap dalam suhu tersebut selama 15 menit. Campuran kemudian diambil, diperas menggunakan kain flannel dan
ditambahkan aquadest hingga didapatkan volume perasan 100 mL infusa biji P. americana
Mill.
6. Penetapan dosis infusa biji alpukat P. americana Mill.
Peringkat dosis yang digunakan untuk dosis infusa biji alpukat P. americana
Mill. didasarkan pada masyarakat, yaitu ± 2 sendok makan 4g yang direbus dalam 250 ml air. Maka dosis perlakuan adalah 4g70kgBB manusia. Dari
data tersebut konversi dosis manusia 70kg ke tikus 200g = 0,018. Dosis untuk tikus 200g = 0,018 x 4g
– 0,72g200gBB = 360 mgkgBB Dosisi untuk tikus 250g =
x 360 = 450
Berdasarkan orientasi yang sudah dilakukan oleh peneliti sebelumnya konsentrasi maksimal infusa biji alpukat adalah 8g100ml dengan berat hewan uji
sebesar 350mg, dan volume maksimal pemberian infusa secara p.o 5ml. Perhitungan untuk menentukan dosis tinggi perlakuan dilakukan dengan
cara sebagai berikut. D x BB = C x V
D x 350g = 8g100ml x 5ml D = 1142,8 mlkgBB
Maka dari hasil data dapat dihitung dosis rendah dan dosis tinggi yang akan diberikan kepada hewan uji. Untuk menentukan peringkat dosis adalah sebagai
berikut. √
= √
= 1,78 Faktor Kelipatan
Dari faktor kelipatan diatas maka dapat diperoleh 4 peringkat dosis sebagai berikut.
Dosis I : 360 mgkgBB : 1,78 = 202,24 mgkgBB Dosis II : 360 mgkgBB
Dosis III : 360 mgkgBB x 1,78 = 640,8 mgkgBB Dosis IV : 450 mgkgBB x 1,78 = 1140,6 mgkgBB
7. Penetapan dosis aquadest sebagai kontrol negatif
Menentukan dosis aquadest yang digunakan ditentukan oleh dosis tertinggi untuk mengetahui jumlah volume maksimal yang harus diberikan pada
hewan uji, berdasarkan rumus didapatkan volume maksimum sebagai berikut. D x BB = C x V
D x 350 g = 1 g100 ml x 5 ml D = 14285 mgkgBB
8. Penyiapan dan pemeliharaan hewan uji
Hewan uji yang digunakan uji toksisitas subakut terdiri dari tikus jantan dan betina, galur Sparague Dawley, umur 2-3 bulan, berat badan 150-250 g,
berjumlah 50 ekor 25 jantan dan 25 betina disiapkan dan ditempatkan dalam kandang. Satu kandang metabolic cage berisi satu tikus sesuai kelompok dosis,
betina dan jantan dipisahkan. Tiga hari sebelum perlakuan hewan uji diadaptasikan pada metabolic cage.
Hewan uji tikus diberikan asupan pakan berupa pellet AD-2 setiap hari sebanyak 30 g dan dilakukan pemberian pakan setiap harinya selama 28 hari masa
perlakuan dan 14 hari masa perlakuan reversibilitas.
Hewan uji tikus diberikan minum berupa air reverse osmosis setiap hari sebanyak 100 ml selama 28 hari masa perlakuan dan 14 hari perlakuan
reversibilitas. Minuman diberikan dalam wadah botol berskala dengan pipa yang diberi lubang pada ujungnya.
Penelitian ini telah mendapat persetujuan Ethical Clearance dari Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada Lampiran 7.
9. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji
Hewan uji yang dibutuhkan sebanyak lima puluh ekor tikus yang dibagi secara acak dalam lima kelompok perlakuan masing-masing sejumlah sepuluh
ekor tikus lima jantan dan lima betina. Kelompok I merupakan kontrol yang diberi aquadest, sedangkan kelompok II , III, IV, dan V merupakan kelompok
perlakuan infusa biji alpukat P. americana Mill. dengan 4 peringkat dosis yaitu 202,24 mgkgBB; 360 mgkgBB; 640,8 mgkgBB; 1140,6 mgkgBB selama 28
hari berturut-turut. Hewan uji yang telah diberi perlakuan setelah 28 hari, masing- masing kelompok perlakuan infusa biji alpukat P. americana Mill. diambil tiga
ekor tikus untuk di lakukan pembedahan agar dapat diamati perubahan struktural yang terjadi pada organ ginjal tikus. Dua ekor tikus yang tidak dibedah pada awal
perlakuan di biarkan selama 14 hari untuk reversibilitas tanpa di beri infusa biji alpukat P. americana Mill. hanya di beri asupan makan dan minum saja.
10. Prosedur pemusnahan hewan percobaan
Hewan uji yang akan dibedah dikorbankan terlebih dahulu dengan cara anestetika overdosis, yakni memasukkan tikus kedalam wadah tertutup berisi eter
yang akan diinhalasi oleh tikus. Hewan uji yang telah dibedah dibedah kemudian diambil organ yang diinginkan dengan menggunakan pinset dan gunting bedah,
kemudian organ dicuci dengan NaCl 0,9 dan dimasukkan ke dalam pot formalin 10 untuk diawetkan. Hewan uji yang sudah diambil organnya, dimasukkan ke
dalam kantong plastik dan dibungkus lagi dengan kertas, diletakkan di dalam tas plastik, ditutup dan dikubur di halaman laboratorium.
11. Pembuatan dan pemeriksaan preparat histologis ginjal
Ginjal yang telah disimpan dalam larutan formalin 10 dicelupkan ke dalam aquadest, kemudian dibuat preparat dan mendiagnosis gambaran histologi
ginjal yang dilakukan oleh pihak Laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
12. Teknik pembuatan slide
a. Trimming
Trimming adalah tahapan yang dilakukan setelah proses fiksasi
denan melakukan pemotongan tipis jaringan setebal 4 mm dengan orientasi sesuai dengan organ yang akan dipotong.
b. Dehidrasi
Dehidrasi jaringan yang dilakukan setelah trimming mengunakan ‘tissue processor’, dimaksudkan untuk mengeluarkan air yang terkandung dalam
jaringan dengan menggunakan cairan dehidran seperti etanol atau iso propil alkohol.
c. Embedding
Jaringan yang berada dalam ‘embedding cassette’ dipindahkan ke
dalam ‘base mold’, setelah melalui proses dehidrasi. Kemudian diisi dengan
parafin cair, kemudian dilekatkan pada balok kayu ukuran 3x3cm atau pada embedding cassette
. Jaringan yang sudah dilekatkan pada balok kayu atau cassette disebut blok. Fungsi dari balok kayu atau cassette adalah untuk pemegang pada
saat balok dipotong pada mikrotom.
d. Cutting
Cutting adalah pemotongan jaringan yang sudah didehidrasi dengan menggunakan mikroton.
e. Staining Pewarnaan
Teknik pewarnaan HE dipergunakan untukpemeriksaan rutin, sedangkan untuk pewarnaan khusus jamur digunakan teknik PAS, kuman tahan
asam digunakan teknik Ziehl-Neelsen. Badan inklusi digunakan teknik Page Gren, Chlamydia digunakan teknik Pinkerton dan untuk deteksi virus digunakan teknik
immunoperoksidase.
f. Mounting
Mounting dilakukan setelah jaringan pada slide diwarnai, dengan
cara meneteskan bahan mounting DPX, Entelan, Canada balsam sesuai kebutuhan dan ditutup dengan „coverglass‟ jangan sampai ada gelembung udara
dibawah coverglass.
g. Pembacaan slide dengan mikroskop
Slide diperiksa di bawah mikroskop cahaya. Semua lesi pada berbagai organ tubuh dicatat.
G. Tata Cara Analisis Hasil
1. Pemeriksaan histologis organ
Data pemeriksaan histopatologis organ dianalisis secara kualitatif dengan menggunakan mikroskop cahaya Olympus DP10 berdasarkan perubahan
morfologi yang terjadi dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif. Data ini digunakan untuk melihat hubungan antara dosis dan spektrum efek toksik.
2. Uji reversibilitas
Uji reversibilitas dilakukan selama 14 hari dimulai setelah perlakuan 28 hari yang dilakukan pada dua hewan uji yang tersisa baik pada kelompok
perlakuan empat peringkat dosis maupun pada kelompok kontrol. Pada uji reversibilitas, pemberian infusa biji alpukat pada kelompok perlakuan serta
aquadest pada kelompok kontrol pada hewan uji dihentikan, namun tetap diberikan asupan makan maupun minum. Setelah hari ke-15 maka dilakukan
pembedahan pada seluruh tikus pada uji reversibilitas dan dilakukan pengamatan histopatologis.
3. Penimbangan berat badan hewan uji
Penimbangan berat badan hewan uji dilakukan setiap hari untuk menentukan volume infusa biji alpukat yang diberikan setiap harinya namun data
yang digunakan sebagai data pendukung adalah data penimbangan hewan uji tiap minggunya. Data penimbangan berat badan hewan uji dihitung purata perubahan
berat badan tiap kelompok hewan uji pada hari ke-0, 7, 14, 21 dan 28. Data perubahan berat badan hewan uji antar minggu dan kelompok perlakuan dianalisis
secara statistik dengan analisis General Linear Model metode Multivariate. Dari hasil General Linear Model metode Multivariate akan terbaca nilai signifikansi
sig. berat badan sehingga akan tampak adanya perubahan berat badan yang signifikan atau tidak.
4. Pengukuran asupan pakan dan minum hewan uji
Data asupan pakan dan minum dianalisis dengan cara menghitung purata makanan dan minuman yang dihabiskan tiap kelompok hewan uji setiap harinya,
kemudian dibuat grafik perubahan pola makan dan minum hewan uji.
H. Skema Alur Penelitian
Kemudian 2 hewan uji sisanya didiamkan selama 14 hari untuk uji reversibilitas, pada hari ke-15 diakukan pembedahan dan pengamatan histopatologi
50 ekor tikus yakni 25 jantan dan 25 betina masing-masing dibagi kedalam 5 kelompok
Hewan uji ditempatkan dalam metabolic cage secara acak dan diadaptasikan selama 3 hari sebelum memulai perlakuan
Hewan uji ditimbang untuk menghitung volume pemberian infusa pada masing masing hewan uji
Hewan uji dikembalikan dalam metabolic cage
Hewan uji diberi infusa biji alpukat secara peroral dan diberi asupan
pakan pada :
Kel.I 202,24 mgkgBB
Kel. II 360 mgkgBB
Kel. III 640,8 mgkgBB
Kel. IV 1140,6 mgkgBB
Kel. Kontrol
Dilakukan pengukuran asupan pakan, minum dan pengamatan berat badan selama 28 hari setiap pagi
Selama 28 hari injeksi infusa biji alpukat secara peroral pada hewan uji dilakukan
pada jam yang sama dengan hari pertama
Pada hari ke-29 diambil 3 hewan uji untuk dilakukan pembedahan dan pengamatan histopatologi
39
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Tujuan umum penelitian ini adalah untuk mengetahui ada tidaknya perubahan histopatologis struktural organ ginjal pada tikus galur Sprague Dawley
yang diberi infusa biji alpukat. Agar lebih memperjelas lagi, tujuan khusus penelitian ini adalah untuk mengetahui sifat efek toksik yang ditimbulkan infusa
biji alpukat P. americana Mill. pada organ ginjal tikus Sprague Dawley. Penelitian ini juga dilakukan untuk melihat reversibilitas efek toksik yang terjadi
pada organ ginjal, perubahan yang dilihat berdasarkan analisis kualitatif histologis ginjal tikus.
Hasil penelitian yang akan dibahas adalah determinasi biji P. americana Mill., penetapan kadar air serbuk biji P. americana Mill., serta pemeriksaan
histologis ginjal tikus. Data pendukung dalam penelitian ini yaitu data asupan pakan dan asupan minum, dan data berat badan. Data berat badan di analisis
dengan General Linear Model metode Multivariate. Data asupan pakan dan minum dibuat grafik untuk melihat apakah pemberian infusa biji P. americana
Mill. dapat mempengaruhi pola makan dan minum hewan uji.
A. Determinasi Biji Persea americana Mill.
Bahan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji alpukat P. americana
Mill.. Tujuan dari determinasi ini adalah untuk membuktikan bahwa serbuk yang digunakan adalah benar biji dari tanaman P. americana Mill.
Kategori