Uji toksisitas subakut infusa biji Alpukat (Persea americana Mill.) terhadap kadar glukosa darah dan gambaran histopatologis pankreas tikus Sprague Dawley.
HISTOPATOLOGIS PANKREAS TIKUS SPRAGUE DAWLEY Marselina Crescentia Tisera
118114152 INTISARI
Tujuan penelitian ini adalah untuk membuktikan efek toksik subakut infusa biji Persea americana Mill. pada tikus Sprague Dawley yang dilihat dari kadar glukosa darah dan gambaran histopatologis pankreas; mengetahui hubungan kekeratan antara dosis infusa biji P. americana Mill. dengan efek toksik subakut dan mengetahui sifat efek toksik dari histopatologis pankreas tikus.
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan menggunakan rancangan penelitian acak lengkap pola searah. Penelitian dilakukan dengan menggunakan 25 tikus jantan dan 25 tikus betina galur Sprague Dawley
dengan berat badan 150-250 g dengan umur 2-3 bulan. Hewan uji dibagi menjadi 5 kelompok secara acak. Kelompok I – IV (kelompok perlakuan) diberi infusa biji P. americana Mill. dengan peringkat dosis berturut-turut 202,24; 360; 640,8 dan 1140,6 mg/kg BB. Kelompok V (kontrol negatif) diberi aquadest dengan dosis 14.285,7 mg/kg BB. Perlakuan dilakukan selama 28 hari. Pada hari ke-29, beberapa hewan uji dikorbankan dan dilakukan pembedahan dengan tujuan untuk melihat histopatologis pankreas. Beberapa hewan uji lainnya dilanjutkan dengan uji reversibilitas selama 14 hari, kemudian juga dikorbankan dan dilakukan pembedahan. Pengamatan organ pankreas dilakukan di bawah mikroskop cahaya (Olympus DP 10®) dengan perbesaran 400x. Pengambilan darah dilakukan sebelum (pre) dan sesudah (post) masa perlakuan untuk pengukuran kadar glukosa darah. Data dianalisis dengan metode One Way ANOVA.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ditemukan adanya efek toksik subakut infusa biji P. americana Mill. pada kadar glukosa darah dan histopatologis pankreas tikus Sprague Dawley. Pada penelitian juga tidak terdapat hubungan antara dosis infusa dengan efek toksik subakut, serta sifat efek toksik histopatologis pankreas tikus tidak dapat diidentifikasi.
Kata kunci : biji Persea americana Mill., infusa, subakut, glukosa, histopatologis pankreas.
(2)
HISTOPATHOLOGIC IN SPRAGUE DAWLEY RATS Marselina Crescentia Tisera
118114152
ABSTRACT
The aim of this study are to prove the subacute toxic effects of Persea americana Mill. seeds infusion on blood glucose levels and pancreas histopathologic of Sprague Dawley rats; determine the relationships between P. americana Mill. seeds infusion doses and subacute toxic effects; and also determine the characteristics of the toxic effects of rat pancreas histopathologic.
This study is a purely experimental study with completely randomized one-way design. The study used 25 male and 25 female Sprague Dawley strain rats, body weight 150-250 g, age 2-3 months. Fifty rats were divided into 5 groups randomly. Group I - IV (treatment group) were given P. americana Mill. seed infusion with successive doses of 202.24; 360; 640.8 and 1140.6 mg/kg. Group V (negative control) was given distilled water 14285.7 mg/kg. The treatment was done for 28 days. On day 29, some of the rats were sacrificed, surgeried and observed pancreas histopathologic. The other rats continued reversibility test for 14 days, then also sacrificed and surgeried. Observations of pancreas under a light microscope (Olympus DP 10®) with a magnification of 400x. Blood sampling performed before (pre) and after (post) treatment period for measurement of blood glucose levels. Data were analyzed by One Way ANOVA method.
The results showed that there were no subacute toxic effects in P. americana
Mill. seeds infusion on blood glucose levels and pancreas histopathologic of Sprague Dawley rats. In the study also found no relationship between infusion doses and subacute toxic effects, and the characteristics of the toxic effects rat pancreas histopathologic can not be identified.
Keywords : Persea americana Mill. seeds, infusion, subacute, glucose, pancreas histopathologic.
(3)
i
UJI TOKSISITAS SUBAKUT INFUSA BIJI ALPUKAT (Persea americana Mill.) TERHADAP KADAR GLUKOSA DARAH DAN GAMBARAN
HISTOPATOLOGIS PANKREAS TIKUS SPRAGUE DAWLEY
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Marselina Crescentia Tisera NIM : 118114152
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
(4)
(5)
(6)
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
Karya ini aku persembahkan untuk
Tuhan Yesus dan Bunda Maria, sumber kekuatan dan pengharapanku, Bapak dan Mama yang selalu mendoakan dan menyemangatiku tiap saat, kakak-kakak dan sahabat-sahabatku, dan Almamaterku.
(7)
v
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Yang Maha Esa atas berkat dan penyertaan-Nya penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi dengan judul “Uji Toksisitas Subakut Infusa Biji Alpukat (Persea americana
Mill.) terhadap Kadar Glukosa Darah dan Gambaran Histopatologis Pankreas Tikus Sprague Dawley”. Penulisan skripsi ini merupakan salah satu syarat dalam memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Penulis menyadari bahwa dalam proses pembuatan skripsi ini tidak terlepas dari bantuan dan dukungan banyak pihak yang telah melancarkan penyelesaian skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas bimbingan dan arahan selama penulis melakukan pembelajaran di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
2. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dosen Penguji skripsi yang telah memberiksan koreksi dan masukan untuk kemajuan penulisan skripsi ini.
3. Bapak Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt. selaku Dosen Penguji skripsi yang telah banyak memberi masukan dan saran kepada penulis.
(8)
vi
4. Ibu drh. Sitarina Widyarini MP., Ph.D. selaku Dosen Pembimbing I sekaligus penguji skripsi atas waktu, arahan, masukan, bimbingan dan motivasi kepada penulis dalam proses penyusunan skripsi ini.
5. Ibu Phebe Hendra, Ph.D., Apt. selaku Dosen Pembimbing II sekaligus penguji skripsi atas waktu, arahan, masukan, bimbingan dan motivasi kepada penulis dalam proses penyusunan skripsi ini.
6. Ibu Dr. Sri Hartati Yuliani, M.Si., Apt. selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi semasa penulis melakukan penelitian yang telah memberikan ijin dalam penggunaan semua fasilitas laboratorium untuk kepentingan penelitian ini.
7. Bapak drh. Sugiyono, M.Sc. yang telah membantu dalam pembacaan preparat histopatologis.
8. Saudara Lilik selaku karyawan Laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada yang telah membantu dalam pembuatan preparat histopatologis.
9. Bapak Suparjiman, bapak Heru Purwanto, bapak Kayatno, bapak Wagiran, bapak Kunto, bapak Suparlan selaku laboran Laboratorium Fakultas Farmasi atas segala bantuan selama pelaksanaan skripsi ini.
10. Seluruh dosen pengajar, staf dan laboran atas dukungan dan bantuan selama penulis menjalani perkuliahan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
(9)
vii
11. Bapak Tisera Antonius dan ibu Saula Seran tersayang atas doa dan motivasi yang tak pernah berhenti mengalir, serta dukungan finansial selama penulis melakukan penyusunan skripsi ini.
12. Kakak-kakak tersayang, Melania Erythrina Tisera dan dr. Simplisius Cornelis Tisera yang selalu mengingatkan penulis saat lengah.
13. Teman-teman seperjuangan dalam skripsi uji toksisitas infusa biji alpukat Levina Apriyani, Christina Desi Kurnia Wati, Betzylia Wahyuningsih, Agustina Iswara Mahanani, Rosita Olimpia Bagiastrasari dan Trifonia Ingrdi Octavia atas semangat, dukungan, bantuan dan kerjasama yang baik bagi penulis dalam menyelesaikan skripsi.
14. Teman-teman kost ‘Difa’, Gemah, kak Lenny, kak Tari atas semangatnya bagi penulis.
15. Teman-teman sepermainan, Regi, Sherly, Rysa, Devi, Rosi, Jeje, Ayuk, Rany, Hensu, Hendy atas dukungan dan kebersamaannya.
16. Semua pihak yang tidak dapat penulis uraikan satu persatu yang telah membantu secara langsung maupun tidak langsung dalam kelancaran penyelesaian skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa tidak ada manusia yang sempurna. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari pihak manapun untuk menjadikan skripsi ini lebih baik. Semoga skripsi ini bermanfaat bagi para pembacanya.
Yogyakarta, 1 Maret 2015 Penulis
(10)
(11)
(12)
x
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ii
HALAMAN PENGESAHAN ... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ... iv
PRAKATA ... v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... viii
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ... ix
DAFTAR ISI ... x
DAFTAR TABEL ... xiv
DAFTAR GAMBAR ... xv
DAFTAR LAMPIRAN ... xvii
INTISARI ... xviii
ABSTRACT ... xix
BAB I PENGANTAR ... 1
A. Latar Belakang ... 1
1. Rumusan masalah ... 3
2. Keaslian penelitian ... 3
3. Manfaat penelitian ... 4
B. Tujuan Penelitian ... 5
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ... 6
(13)
xi
1. Nama daerah ... 6
2. Klasifikasi ... 6
3. Morfologi ... 7
4. Kandungan ... 7
5. Khasiat dan kegunaan ... 8
B. Infusa ... 8
C. Toksikologi ... 9
1. Kondisi, mekanisme, wujud dan sifat efek toksik racun ... 9
2. Faktor-faktor yang mempengaruhi ketoksikan racun ... 10
D. Toksisitas Subakut ... 11
E. Pankreas ... 12
1. Anatomi fisiologi ... 12
2. Efek toksik pada pankreas ... 17
F. Glukosa Darah ... 17
G. Keterangan Empiris ... 20
BAB III METODE PENELITIAN ... 21
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 21
B. Variabel dan Definisi Operasional ... 21
1. Variabel utama ... 21
2. Variabel pengacau ... 22
3. Definisi operasional ... 22
C. Bahan Penelitian ... 23
(14)
xii
E. Tata Cara Penelitian ... 24
1. Determinasi tanaman ... 24
2. Pengumpulan biji P. americana Mill. ... 24
3. Pembuatan serbuk biji P. americana Mill. ... 24
4. Penetapan kadar air biji P. americana Mill. ... 25
5. Pembuatan infusa biji P. americana Mill. ... 25
6. Penetapan dosis infusa P. americana Mill. ... 25
7. Penetapan dosis aquadest sebagai kontrol negatif ... 27
8. Penyiapan dan pemeliharaan hewan uji ... 27
9. Pengelompokkan dan prosedur pelaksanaan toksisitas subakut .. 28
10. Prosedur pemusnahan hewan percobaan ... 28
11. Pembuatan preparat histopatologis ... 29
12. Pengamatan uji toksisitas subakut ... 30
a. Penimbangan berat badan hewan uji ... 30
b. Pengukuran asupan pakan hewan uji ... 30
c. Pengukuran asupan minum hewan uji ... 30
F. Tata Cara Analisis Hasil ... 31
1. Pengamatan berat badan hewan uji ... 31
2. Pengukuran asupan pakan hewan uji ... 31
3. Pengukuran asupan minum hewan uji ... 31
4. Analisis kadar glukosa dalam darah hewan uji ... 31
5. Pengamatan histopatologis hewan uji ... 32
(15)
xiii
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 34
A. Determinasi Tanaman ... 34
B. Serbuk dan Kadar Air Serbuk Biji P. americana Mill. ... 34
C. Pengaruh Pemberian Infusa Biji P. americana Mill. Terhadap Kadar Glukosa Darah Tikus ... 35
D. Pengaruh Pemberian Infusa Biji P. americana Mill. Terhadap Gambaran Histopatologis Pankreas Tikus ... 40
E. Uji Reversibilitas ... 43
F. Pengaruh Pemberian Infusa Biji P. americana Mill. Terhadap Perubahan Berat Badan Tikus ... 46
G. Pengaruh Pemberian Infusa Biji P. americana Mill. Terhadap Perubahan Asupan Pakan Tikus ... 50
H. Pengaruh Pemberian Infusa Biji P. americana Mill. Terhadap Perubahan Asupan Minum Tikus ... 52
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 55
A. Kesimpulan ... 55
B. Saran ... 55
DAFTAR PUSTAKA ... 56
LAMPIRAN ... 59
(16)
xiv
DAFTAR TABEL
Tabel I. Kadar glukosa darah normal tikus Sprague Dawley ... 18
Tabel II. Purata + SE kadar glukosa darah pemberian infusa biji P.
americana Mill. pada tikus jantan serta nilai p kadar glukosa tiap kelompok ... 37
Tabel III. Purata + SE kadar glukosa darah pemberian infusa biji P.
americana Mill. pada tikus betina serta nilai p kadar glukosa tiap kelompok ... 39
Tabel IV. Presentase hasil pemeriksaan histopatologis pankreas tikus
masa perlakuan ... 41
Tabel V. Presentase hasil pemeriksaan histopatologis pankreas tikus
uji reversibilitas ... 44
Tabel VI. Purata + SE berat badan tikus jantan akibat pemberian
infusa biji P. americana Mill... 47
Tabel VII. Purata + SE berat badan tikus betina akibat pemberian
(17)
xv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Buah P. americana Mill. ... 6
Gambar 2. Pankreas ... 13
Gambar 3. Sel asinus ... 14
Gambar 4. Pulau Langerhans ... 16
Gambar 5. Gambaran metabolisme karbohidrat ... 19
Gambar 6. Skema alur penelitian ... 33
Gambar 7. Diagram batang purata kadar glukosa darah tikus jantan antar kelompok perlakuan akibat pemberian infusa biji P. americana Mill. ... 38
Gambar 8. Diagram batang purata kadar glukosa darah tikus betina antar kelompok perlakuan akibat pemberian infusa biji P. americana Mill. ... 39
Gambar 9. Pulau Langerhans normal (Aquadest 14.285,7 mg/kg BB) . 41 Gambar 10. Pulau Langerhans normal (Infusa biji P. americana Mill. 1.140,6 mg/kg BB) ... 42
Gambar 11. Pulau Langerhans normal uji reversibilitas (Aquadest 14.285,7 mg/kg BB) ... 45
Gambar 12. Pulau Langerhans normal uji reversibilitas (Infusa biji P. americana Mill. 1.140,6 mg/kg BB) ... 46
(18)
xvi
Gambar 13. Nekrosis pulau Langerhans uji reversibilitas (Infusa biji P.
americana Mill. 360 mg/kg BB) ... 46
Gambar 14. Grafik perubahan berat badan tikus jantan selama
pemberian infusa biji P. americana Mill. menurut
kelompok dosis pada hari ke-1 sampai hari ke-28 ... 48
Gambar 15. Grafik perubahan berat badan tikus betina selama
pemberian infusa biji P. americana Mill. menurut
kelompok dosis pada hari ke-1 sampai hari ke-28 ... 49
Gambar 16. Grafik asupan pakan tikus jantan selama pemberian infusa
biji P. americana Mill. menurut kelompok dosis pada hari ke-0 sampai hari ke-28 ... 51
Gambar 17. Grafik asupan pakan tikus betina selama pemberian infusa
biji P. americana Mill. menurut kelompok dosis pada hari ke-0 sampai hari ke-28 ... 51
Gambar 18. Grafik asupan minum tikus jantan selama pemberian infusa
biji P. americana Mill. menurut kelompok dosis pada hari ke-0 sampai hari ke-28 ... 53
Gambar 19. Grafik asupan minum tikus betina selama pemberian infusa
biji P. americana Mill. menurut kelompok dosis pada hari ke-0 sampai hari ke-28 ... 53
(19)
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Biji P. americana Mill. ... 60
Lampiran 2. Serbuk Biji P. americana Mill. ... 60
Lampiran 3. Pembuatan Infusa Biji P. americana Mill. ... 60
Lampiran 4. Infusa Biji P. americana Mill. ... 61
Lampiran 5. Perhitungan penetapan peringkat dosis infusa biji Biji P. americana Mill. pada kelompok perlakuan ... 61
Lampiran 6. Perhitungan konversi dosis untuk manusia ... 62
Lampiran 7. Kadar air serbuk biji P. americana Mill. ... 62
Lampiran 8. Surat Determinasi ... 63
Lampiran 9. Surat Hasil Histopatologis ... 64
Lampiran 10. Surat Ethics Committee Approval ... 66
Lampiran 11. Analisis statistik kadar glukosa darah pre dan post pada tikus jantan melalui uji Paired T-Test ... 68
Lampiran 12. Analisis statistik kadar glukosa darah post pada tikus jantan 69 Lampiran 13. Analisis statistik kadar glukosa darah pre dan post pada tikus betina melalui uji Paired T-Test ... 71
Lampiran 14. Analisis statistik kadar glukosa darah post pada tikus betina 72 Lampiran 15. Analisis statistik berat badan tikus jantan ... 74
(20)
xviii
INTISARI
Tujuan penelitian ini adalah untuk membuktikan efek toksik subakut infusa biji Persea americana Mill. pada tikus Sprague Dawley yang dilihat dari kadar glukosa darah dan gambaran histopatologis pankreas; mengetahui hubungan kekeratan antara dosis infusa biji P. americana Mill. dengan efek toksik subakut dan mengetahui sifat efek toksik dari histopatologis pankreas tikus.
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan menggunakan rancangan penelitian acak lengkap pola searah. Penelitian dilakukan dengan menggunakan 25 tikus jantan dan 25 tikus betina galur Sprague Dawley
dengan berat badan 150-250 g dengan umur 2-3 bulan. Hewan uji dibagi menjadi 5 kelompok secara acak. Kelompok I – IV (kelompok perlakuan) diberi infusa biji P. americana Mill. dengan peringkat dosis berturut-turut 202,24; 360; 640,8 dan 1140,6 mg/kg BB. Kelompok V (kontrol negatif) diberi aquadest dengan dosis 14.285,7 mg/kg BB. Perlakuan dilakukan selama 28 hari. Pada hari ke-29, beberapa hewan uji dikorbankan, dibedah dan diamati histopatologis pankreas. Beberapa hewan uji lainnya dilanjutkan dengan uji reversibilitas selama 14 hari, kemudian juga dikorbankan dan dilakukan pembedahan. Pengamatan organ pankreas dilakukan di bawah mikroskop cahaya (Olympus DP 10®) dengan perbesaran 400x. Pengambilan darah dilakukan sebelum (pre) perlakuan pada hari ke-0 dan sesudah (post) perlakuan pada hari ke-29 untuk pengukuran kadar glukosa darah. Data dianalisis dengan metode One Way ANOVA.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ditemukan adanya efek toksik subakut infusa biji P. americana Mill. pada kadar glukosa darah dan histopatologis pankreas tikus Sprague Dawley. Pada penelitian juga tidak terdapat hubungan antara dosis infusa dengan efek toksik subakut, serta sifat efek toksik histopatologis pankreas tikus tidak dapat diidentifikasi.
Kata kunci : biji Persea americana Mill., infusa, subakut, glukosa, histopatologis pankreas.
(21)
xix ABSTRACT
The aim of this study are to prove the subacute toxic effects of Persea americana Mill. seeds infusion on blood glucose levels and pancreas histopathologic of Sprague Dawley rats; determine the relationships between P. americana Mill. seeds infusion doses and subacute toxic effects; and also determine the characteristics of the toxic effects of rat pancreas histopathologic.
This study is a purely experimental study with completely randomized one-way design. The study used 25 male and 25 female Sprague Dawley strain rats, body weight 150-250 g, age 2-3 months. Fifty rats were divided into 5 groups randomly. Group I - IV (treatment group) were given P. americana Mill. seed infusion with successive doses of 202.24; 360; 640.8 and 1140.6 mg/kg. Group V (negative control) was given distilled water 14285.7 mg/kg. The treatment was done for 28 days. On day 29, some of the rats were sacrificed, surgeried and observed pancreas histopathologic. The other rats continued reversibility test for 14 days, then also sacrificed and surgeried. Observations of pancreas under a light microscope (Olympus DP 10®) with a magnification of 400x. Blood sampling performed before (pre) and after (post) treatment period for measurement of blood glucose levels. Data were analyzed by One Way ANOVA method.
The results showed that there were no subacute toxic effects in P. americana Mill. seeds infusion on blood glucose levels and pancreas histopathologic of Sprague Dawley rats. In the study also found no relationship between infusion doses and subacute toxic effects, and the characteristics of the toxic effects rat pancreas histopathologic can not be identified.
Keywords : Persea americana Mill. seeds, infusion, subacute, glucose, pancreas histopathologic.
(22)
1
BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang
Indonesia kaya akan flora dan fauna. Kekayaan flora yang dimiliki Indonesia salah satunya dimanfaatkan sebagai obat tradisional. Masyarakat Indonesia menganggap bahwa obat tradisional bebas dari efek samping, murah dan mudah diakses. Salah satu flora yang sering digunakan dalam pengobatan tradisional yaitu tanaman alpukat dengan nama Latin Persea americana Mill..
Buah P. americana Mill. dengan warna kulit yang hijau muda dan daging buah yang lembut berwarna kuning pucat kaya akan asam lemah, seperti linoleat, oleat, palmitat, dan stearat. Buah P. americana Mill. biasanya dikonsumsi sebagai sumber vitamin, tetapi telah digunakan juga sebagai tanaman obat di Meksiko dan negara lainnya di dunia. Buah ini sering digunakan masyarakat Indonesia sebagai obat tradisional untuk menurunkan kolesterol darah, mengobati sariawan, meningkatkan kekebalan tubuh dan mencegah kanker prostat. Tidak hanya bagian daging buahnya saja, tapi bagian lain pada buah P. americana Mill. ini juga memiliki banyak khasiat. Daun P. americana Mill. dapat mengobati penyakit darah tinggi, sakit pinggang dan kencing batu, sedangkan biji P. americana Mill. dapat mengobati kencing manis, maag, mengurangi sakit pada gigi berlubang dan bengkak pada peradangan. Banyak opini pada masyarakat yang menganggap biji P. americana Mill. merupakan limbah, sedangkan dari penelitian yang telah dilakukan, diketahui bahwa biji P. americana Mill. memiliki kandungan metabolit, seperti flavonoid, alkaloid, fitosterol, triterpen, asam lemak dam asam absisat.
(23)
Beberapa aktivitas biologis yang dimiliki biji P. americana Mill., yaitu sebagai antioksidan, antihipertensi, larvisida, fungisida, hipolipidemik dan amoebicidal
(Chamberos, Velazquez, Fernandez and Rodriguez, 2013).
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Putri (2013), pemberian infusa biji P. americana Mill. dapat memberikan efek hepatoprotektif terhadap aktivitas ALT-AST serum tikus yang terinduksi karbon tetraklorida. Selain itu, pada penelitian Yoseph (2013) menyatakan bahwa pemberian infusa biji P. americana Mill. dalam jangka panjang memberikan efek nefroprotektif terhadap kadar kreatinin dan gambaran histologi ginjal tikus yang terinduksi karbon tetraklorida. Berkaitan dengan hal tersebut, hingga kini belum diketahui pengaruh penggunaan biji P. americana Mill. dalam jangka panjang apakah menimbulkan efek toksik bagi organ tubuh, sehingga perlu dilakukan uji toksisitas tak khas. Uji toksisitas tak khas merupakan uji toksisitas yang dirancang untuk mengevaluasi keseluruhan atau spektrum efek toksik suatu senyawa pada hewan uji. Penelitian dilakukan secara paralel dan yang diamati pada penelitian ini adalah histopatologis pankreas dan kadar glukosa darah.
Pankreas merupakan organ pada sistem pencernaan yang memiliki fungsi utama, yaitu menghasilkan enzim pencernaan serta beberapa hormon penting untuk metabolisme tubuh, seperti insulin dan glukagon. Pankreas juga bertanggung jawab dalam menjaga kadar glukosa dalam darah (Snell, 2002). Contoh kerusakan organ pankreas yang sering terjadi karena efek toksik dari suatu senyawa, yaitu pankreatitis dan kanker pankreas. Hal ini dapat menurunkan fungsi kerja dari pankreas dan dapat mengganggu metabolisme tubuh.
(24)
Penelitian ini dilakukan untuk menguji toksisitas subakut, yaitu dalam jangka waktu 28 hari karena sebagian besar masyarakat menggunakan obat tradisional ini dalam jangka waktu yang relatif lama. Biji P. americana Mill. dibuat dalam bentuk sediaan infusa karena masyarakat sering mengkonsumsi biji P. americana Mill. dengan cara merebus. Penelitian toksisitas subakut infusa biji P. americana Mill. ini berjalan bersamaan dengan penelitian toksisitas akut. Diharapkan dengan adanya penelitian ini, didapatkan informasi ketoksikan biji P. americana Mill. terhadap organ pankreas dan kadar glukosa darah dalam jangka waktu 28 hari.
1. Rumusan masalah
a. Apakah pemberian infusa biji P. americana Mill. secara subakut menimbulkan efek toksik pada kadar glukosa darah dan gambaran histopatologis pankreas tikus Sprague Dawley?
b. Apakah ada hubungan kekerabatan antara dosis infusa biji P. americana
Mill. dengan kadar glukosa darah dan histopatologis pankreas tikus
Sprague Dawley?
c. Apa sifat efek toksik pada gambaran histopatologis pankreas tikus Sprague Dawley?
2. Keaslian penelitian
Penelitian yang telah dilakukan berkaitan dengan biji P. americana Mill., di antaranya :
(25)
a. Penelitian yang dilakukan oleh Arukwe et al. (2012) bertujuan untuk mengetahui kandungan dari biji, daun dan buah P. americana Mill. b. ”Pengaruh Pemberian Infusa Biji Alpukat (Persea americana Mill.)
terhadap Kadar Glukosa Darah Tikus Wistaryang Diberi Beban Glukosa”
menyatakan bahwa pemberian infusa biji alpukat 0,315 dan 1,26 g/kg BB dapat menurunkan kadar glukosa darah tikus Wistar yang diberi beban glukosa. Pemberian infusa biji alpukat 0,315 g/kg BB dapat menurunkan kadar glukosa darah lebih besar daripada pemberian infusa biji alpukat 1,26 g/kg BB (Anggraeni, 2006).
c. Penelitian yang dilakukan oleh Alhassan et al. (2012) membuktikan bahwa pemberian ekstrak air biji P. americana Mill. memiliki efek hipoglikemik pada tikus yang terinduksi aloksan. Ekstrak air biji P. americana Mill. dosis 20, 30 dan 40 g/L yang diinduksi bersama aloksan mampu menurunkan kadar glukosa darah tikus albino dalam 21 hari.
Sejauh ini penelitian tentang uji toksisitas subakut infusa biji P. americana
Mill. terhadap kadar glukosa dalam darah dan gambaran histopatologis pankreas tikus Sprague Dawley belum pernah dilakukan sebelumnya.
3. Manfaat penelitian a. Manfaat teoritis
Penelitian ini diharapkan memberikan manfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan, khususnya ilmu kefarmasian, mengenai efek toksisitas subakut infusa
(26)
biji P. americana Mill. terhadap kadar glukosa dalam darah dan gambaran histopatologis pankreas.
b. Manfaat praktis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada masyarakat mengenai toksisitas infusa biji P. americana Mill. pada penggunaan berulang untuk jangka waktu yang relatif lama terhadap kadar glukosa dalam darah dan gambaran histopatologis pankreas.
B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum
Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan ada tidaknya potensi efek toksik subakut dari infusa biji P. americana Mill. terhadap pankreas tikus. 2. Tujuan khusus
a. Untuk membuktikan pemberian infusa biji P. americana Mill. secara subakut menimbulkan efek toksik pada kadar glukosa darah dan gambaran histopatologis pankreas tikus Sprague Dawley.
b. Untuk mengetahui hubungan kekerabatan antara dosis infusa biji P. americana Mill. dengan kadar glukosa darah dan gambaran histopatologis pankreas tikus Sprague Dawley.
c. Untuk mengetahui sifat efek toksik pada gambaran histopatologis pankreas tikus Sprague Dawley.
(27)
6
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Tanaman Alpukat (Persea Americana Mill.)
Gambar 1. Buah P. americana Mill. (Anonim, 2014) 1. Nama daerah
Avokad, alpukat (Indonesia), apokat, alpokat (Melayu), arpuket (Sunda), alpokat (Jawa), alpuket (Betawi) (Suhono dkk., 2010).
2. Klasifikasi
Kingdom : Plantae
Subkingdom : Tracheobionta Super Divisi : Spermatophyta Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Sub Kelas : Magnoliidae Ordo : Laurales Famili : Lauraceae Genus : Persea
(28)
3. Morfologi
Pohon selalu hijau dengan tinggi mencapai 20 m. Daun tunggal, tersusun spiral, tepi daun rata; panjang tangkai daun 1.5-5 cm; daun berbentuk elips hingga lanset, bulat telur hingga bulat telur sungsang, panjang daun 5-40 cm dan lebar 3-15 cm, permukaan atas daun diselaputi lilin. Perbungaan berupa tongkol majemuk (malai) yang muncul di ujung cabang; bunga banci tersusun atas 3 daun mahkota, memiliki bau harum; perhiasan bunga tersusun atas dua lingkaran; benang sari 9 di dalam 3 lingkaran; kumpulan benang sari di bagian dalam mengeluarkan 2 nektar di bagian dasarnya; putik terdiri atas satu ruang bakal buah, tangkai kepala putik ramping dengan kepala putik tunggal (simple papillate stigma). Buah (Gambar 1.) besar berdaging dan berair (berry), berbiji tunggal, permukaan buah halus, panjang 7-20 cm. Buah besar dan bulat, dilapisi dua lapisan dan dua kotiledon besar yang melindungi embrio kecil (Proseanet, 2014).
Kandungan fitokimia yang penting yang ditemukan dalam P. americana Mill. yaitu kandungan saponin, tanin, flavonoid, alkaloid dan fenol (Okwu and Okwu, 2004), sedangkan berdasarkan penelitian Arukwe et al. (2012), kandungan biji P. americana Mill. adalah saponin, tanin, flavonoid,
cyanogenic glycosides, alkaloid, fenolik dan steroid. Biji P. americana Mill.
memiliki kandungan fenolik paling tinggi jika dibandingkan dengan daun dan buah P. americana Mill.
(29)
Penggunaan ekstrak air biji alpukat juga dapat mengurangi kadar kolesterolol total, trigliserida, dan kolesterol LDL (Nwaoguikpe and Braide, 2011) karena adanya kandungan betasitosterol dan tokoferol pada biji alpukat. Anaka, Ozolua dann Okpo (2009) melaporkan ekstrak air biji P. americana Mill.
dapat menurunkan tekanan darah. Selain itu, biji buah alpukat bersifat nefroprotektif pada tikus jantan yang terinduksi karbon tetraklorida (Yoseph, 2013).
B. Infusa
Infusa didefinisikan sebagai sediaan cair yang dibuat dengan mengekstraksi simplisia nabati dengan air pada suhu 90oC selama 15 menit (Badan Pengawas Obat dan Makanan, 2010). Pembuatan sediaan infusa adalah dengan mencampur simplisia yang telah diayak dengan derajat halus yang sesuai dalam panci dengan air secukupnya. Pemanasan dilakukan di atas penangas air selama 15 menit terhitung sejak mencapai 90oC yang disertai dengan pengadukan. Penyerkaian dilakukan menggunakan kain flannel yang disertai dengan menambahkan air panas secukupnya melalui ampas hingga diperoleh volume infus yang dikehendaki (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995). 5. Khasiat dan kegunaan
(30)
C. Toksikologi
Toksikologi merupakan ilmu yang mempelajari aksi berbahaya zat kimia atas sistem biologi. Definisi ini menunjukkan bahwa objek yang dipelajari dalam toksikologi adalah antaraksi zat kimia atau senyawa asing dengan sistem biologi atau makhluk hidup, yang pusat perhatiannya terletak pada aksi berbahaya zat kimia tersebut (Donatus, 2001).
1. Kondisi, mekanisme, wujud dan sifat efek toksik racun a. Kondisi efek toksik
Kondisi efek toksik adalah keadaan atau faktor yang mempengaruhi keefektifan absorpsi, distribusi dan eliminasi zat beracun di dalam tubuh sehingga menentukan keberadaan (kadar dan lama tinggal) senyawa atau metabolitnya di tempat aksi dan keefektifan antaraksinya (mekanisme aksi). Keadaan ini bergantung pada kondisi pemejanan dan kondisi makhluk hidup (Donatus, 2001). b. Mekanisme aksi
Mekanisme aksi toksik racun dapat digolongkan menjadi tiga, yakni mekanisme berdasarkan sifat dan tempat kejadian, berdasarkan sifat antaraksi antara racun dan tempat aksinya dan berdasarkan risiko penumpukan racun dalam gudang penyimpanan tubuh (Donatus, 2001).
c. Wujud efek toksik
Wujud efek toksik adalah hasil akhir dari aksi dan respon toksik. Respon toksik merupakan suatu proses di mana sel, jaringan atau organ menanggapi adanya luka dalam komponen-komponen tubuhnya. Respon yang terjadi merupakan hasil dari (1) perubahan biokimia terhadap luka sel akibat antaraksi racun dan tempat
(31)
aksinya. Termasuk efek toksik jenis ini di antaranya penghambatan respoirasi selular, perubahan keseimbangan cairan dan elektrolit dan gangguan pasok energi. Perubahan biokimia pada umumnya bersifat terbalikkan; (2) perubahan fisiologis (fungsional) yang berkaitan dengan antaraksi racun dengan reseptor atau tempat aktif enzim sehingga mempengaruhi fungsi homeostasis tertentu. Perubahan ini bersifat terbalikkan. Termasuk efek toksik jenis ini di antaranya anoksia, gangguan pernapasan, perubahan kontraksi dan relaksasi otot, dan gangguan sistem saraf pusat; (3) perubahan struktural, yang biasanya diawali oleh perubahan biokimia atau fungsional. Termasuk dalam jenis ini di antaranya perlemakan, nekrosis, karsinogenesis dan teratogenesis (Donatus, 2001).
d. Sifat efek toksik
Sifat efek toksik meliput reversibilitas (terbalikkan) dan irreversibilitas (tak terbalikkan). Dikatakan terbalikkaan jika efek toksik yang terjadi dapat kembali seperti keadaan normal atau seperti sebelum terjadi efek toksik. Keterbalikkan ini tergantung dari sejumlah faktor, termasuk tingkat paparan (waktu dan jumlah racun) dan kemampuan jaringan yang terkena untuk memperbaiki diri atau beregenarasi. Sifat tak terbalikkan adalah jika efek toksik yang terjadi menetap atau tidak dapat kembali seperti keadaan normal (Williams, James and Roberts, 2000).
2. Faktor-faktor yang mempengaruhi ketoksikan racun
Pada dasarnya, aneka ragam faktor yang dapat mempengaruhi ketoksikan racun dapat digolongkan menjadi dua, yakni faktor yang berasal dari racun (faktor
(32)
intrinsik racun) dan faktor yang berasal dari makhluk hidupnya (faktor intrinsik makhluk hidup).
Racun merupakan zat kimia. Karena itu ketoksikan racun tak lepas dari sifat fisika dan kimia bawaan racun tersebut. Faktor intrinsik racun melipputi faktor kimia, kondisi pemejanan, pengolahan, pengawetan, pengentalan dan pengepakkan. Bergantung pada sifat dan berbagai proses yang dapat mempengaruhi sifat racun maka berbagai faktor tersebut dapat mempengaruhi keefektifan translokasi atau antaraksi racun dengan tempat aksinya.
Faktor intrinsik makhluk hidup merupakan kondisi fisiologis (berat badan, umur, suhu tubuh, kecepatan pengosongan lambung, kapasistas fungsional cadangan, penyimpanan racun, kecepatan alir darah, status gizi, jenis kelamin, kehamilan, genetika, irama siskardian, irama diurnal) dan kondisi patologis pada makhluk hidup (penyakit) (Donatus, 2001).
D. Toksisitas Subakut
Jenis uji toksikologi dibagi menjadi dua golongan yaitu uji ketoksikan khas dan uji ketoksikan tak khas. Uji ketoksikan khas (uji toksistas akut, subkronis dan kronis) merupakan uji untuk mengevaluasi secara rinci efek yang khas sesuatu senyawa pada aneka ragam jenis hewan uji, sedangkan uji ketoksikan tak khas merupakan uji yang dirancang untuk mengevaluasi keseluruhan atau spektrum efek toksik suatu senyawa pada aneka ragam jenis hewan uji (Donatus, 2001).
Uji toksisitas subkronis yang biasanya disebut juga subakut merupakan uji ketoksikan suatu senyawa yang diberikan dengan dosis berulang pada hewan uji
(33)
tertentu, selama kurang dari tiga bulan. Uji ini ditujukan untuk mengungkapkan spektrum efek toksik senyawa uji, serta untuk memperlihatkan apakah spektrum efek toksik itu berkaitan dengan takaran dosis (Donatus, 2001).
Jumlah hewan uji yang digunakan untuk uji ketoksikan subkronis adalah lima ekor untuk masing-masing jenis kelamin dalam tiap kelompok perlakuan. Hewan uji harus diadaptasikan dahulu selama beberapa hari sebelum dilakukan percobaan agar kondisi hasil percobaan yang diperoleh benar-benar merupakan pengaruh pemberian perlakuan, bukan karena lingkungan yang baru bagi hewan uji (Derelanko and Hollinger, 2002).
E. Pankreas 1. Anatomi fisiologi
Pankreas adalah organ berupa kelenjar yang berada pada abdomen. Pankreas merupakan bagian dari sistem pencernaan dan menghasilkan enzim dan hormon penting yang membantu dalam mencerna makanan. Pankreas dengan panjang dan tebal sekitar 12,5 cm dan tebal + 2,5 cm terbentang dari atas sampai ke lengkungan besar dari perut dan biasanya dihubungkan oleh dua saluran ke duodenum (usus 12 jari), terletak pada dinding posterior abdomen di belakang peritoneum sehingga termasuk organ retroperitonial kecuali bagian kecil caudanya yang terletak dalam ligamentum lieonorenalis. Strukturnya lunak dan berlobulus (Snell, 2002). Pankreas terdiri dari tiga bagian, yaitu :
a) Kepala pankreas. Bagian yang paling lebar, terletak di sebelah kanan rongga abdomen dan di dalam lekukan duodenum.
(34)
b) Badan pankreas. Bagian utama pada pankreas yang terletak di belakang lambung dan di depan vertebra lumbalis pertama.
c) Ekor pankreas. Bagian runcing di sebelah kiri, yang memanjang hingga menyentuh limpa (Ross and Pawlina, 2011).
Gambar 2. Pankreas (Anonim b, 2015)
Pankreas (Gambar 2.) memiliki dua saluran yang mengalirkan hasil sekresi pankreas ke dalam duodenum, yaitu 1) Duktus Wirsung, yang bersatu dengan duktus choledukus, masuk ke dalam duodenum melalui sphincter oddi; dan 2) Duktus Sartorini, yang ukurannya lebih kecil, masuk ke dalam duodenum di bagian atas sphincter oddi. Saluran ini dapat menghantarkan rangsang dari pankreas dan mengosongkan duodenum sekitar 2,5 cm di atas ampula hepatopankreatik. Pankreas terdiri dari dua kelenjar, yaitu kelenjar eksokrin dan kelenjar endokrin. Berbeda dengan hati, di mana fungsi eksokrin dan endokrin berada dalam sel yang sama, fungsi ganda pankreas ini diturunkan pada dua komponen struktural yang berbeda. Komponen eksokrin mensintesis dan mensekresi enzim ke dalam duodenum yang penting untuk pencernaan di usus.
(35)
Komponen endokrin mensintesis dan mensekreasi hormon insulin dan glukagon ke dalam darah. Hormon tersebut mengatur metabolisme glukosa, lipid dan protein dalam tubuh. Pankreas eksokrin dapat ditemukan di seluruh bagian organ pankreas. Dalam pankreas eksokrin, terdapat masa sel yang berbeda yang disebut kepulauan Langerhans yang letaknya menyebar dan merupakan pankreas endokrin (Ross and Pawlina, 2011).
1) Eksokrin
Pankreas eksokrin terdiri dari kelenjar serous. Kelenjar ini terdiri dari ribuan lobus yang berikatan dengan bebas. Diameter lobus sekitar 3 mm. Lobus dipisahkan oleh septa jaringan ikat yang tipis. Setiap lobus mengandung sel asinus yang memiliki bentuk dan ukuran yang beragam. Asinus dengan panjang 160 µm dengan bentuk yang menekuk memiliki permukaan seperti bonggol (Gambar 3.). Biasanya kumpulan sel asinus terdiri atas 3-5 sel. Pada sel asinus terdapat granula zimogen dengan diameter 0,5-1 µm yang terletak di tengah yang mengandung enzim pencernaan. Jumlah granula zimogen yang ada tergantung dengan fungsi sel (Kuehnel, 2003).
(36)
Sel asinus menghasilkan getah pankreas yang mengandung enzim-enzim pencernaan seperti enzim-enzim amilase pankreas (amylopsin) yang memecah pati menjadi maltosa dan glukosa; enzim lipase pankreas yang menghidrolisis lemak menjadi campuran asam lemak dan monogliserida; dan enzim-enzim proteolitik (tripsin, kimotripsin). Getah pankreas disebut juga enzim pankreas. Pengeluaran getah pankreas dipengaruhi oleh hormon yang dihasilkan oleh sel-sel sel-selaput lendir saluran pencermaam. Umumnya saluran pankreas dan empedu bermuara jadi satu di sebuah lubang kecil pada dinding duodenum. Pada lubang tersebut terdapat katup yang berfungsi mencegah enzim naik kembali ke pankreas karena enzim yang sudah keluar tidak dapat diserap kembali oleh pankreas (Sloane, 2003).
2) Endokrin
Sebagai endokrin, pankreas tersebar di antara alveoli pankreas, dapat ditemukan dalam pulau-pulau Langerhans (Gambar 4.), yaitu kumpulan kecil sel yang tersebar di seluruh organ. Ada 4 jenis sel penghasil hormon dalam pulau-pulau Langerhans, yaitu (1) sel alfa, dengan jumlah sekitar 20-40% yang memproduksi glukagon yang menjadi faktor hiperglikemik, suatu hormon yang mempunyai antiinsulin like activity; (2) sel beta mensekresi insulin yang menurunkan kadar glukosa dalam darah; (3) sel delta mensekresi somastatin, hormon penghalang hormon pertumbuhan yang menghambat sekresi glukagon dan insulin; dan (4) sel F yang mensekresikan polipeptida pankreas, sejenis hormon pencernaan untuk fungsi yang tidak jelas (Sloane, 2003).
(37)
Gambar 4. Pulau Langerhans : 1) Sel asinus serous, pankreas eksokrin; 2) Sel α (sel A); 3) Sel
β (sel B); 4) Nekrosis sel β; 5) Sel lemak. [Stain: a) Ivic; magnification: x64; b) alum hematoxylin-eosin; magnification: x100] (Kuehnel, 2003)
Insulin merupakan hormon yang terdiri dari rangkaian asam amino, dihasilkan oleh sel beta kelenjar pankreas. Dalam keadaan normal, bila ada rangsangan pada sel beta, insulin disintesis dan kemudian disekresikan ke dalam darah sesuai dengan kebutuhan tubuh untuk keperluan regulasi glukosa darah. Mekanisme tersebut diperlukan bagi berlangsungnya proses metabolisme glukosa, sehubungan dengan funsi insulin dalam proses utilasi glukosa dalam tubuh. Kadar glukosa darah yang meningkat merupakan komponen utama yang memberi rangsangan terhadap sel beta memproduksi insulin, meskipun beberapa jenis asam amino dan obat-obatan, juga dapat memiliki efek yang sama (Manaf, 2006).
(38)
2. Efek toksik pada pankreas
Pankreas merupakan organ vital yang berperan dalam sistem pencernaan dan metabolisme tubuh. Banyak toksin yang dapat menimbulkan kerusakan pada organ pankreas. Efek toksik yang timbul berupa perubahan-perubahan pada struktur dan fungsi pankreas, yaitu perubahan-perubahan pada membran sel, meningkatkan fluiditas dan mengubah permeabilitasnya terhadap ion, asam amino dan senyawa lain yang penting untuk metabolisme sel. Melalui mekanisme neurohumoral, senyawa toksin dapat mengubah sekresi kelenjar eksokrin pankreas. Efek toksin lain yang dapat ditimbulkan pada organ pankreas yaitu nekrosis dan edema akut, serta pankreatitis akut, kronis maupun asimtomatis (Derelanko and Hollinger, 2002).
F. Glukosa Darah
Glukosa merupakan bentuk karbohidrat yang paling sederhana, diabsorpsi ke dalam cairan darah melalui sistem pencernaan. Glukosa darah adalah gula yang terdapat dalam darah yang terbentuk dari karbohidrat dalam makanan dan disimpan sebagai glikogen di hati dan otot rangka (Lee, 2007). Kadar glukosa darah akan meningkat setelah makan dan akan turun pada level terendah pada pagi hari sebelum makan. Kadar glukosa darah diatur melalui umpan balik negatif untuk mempertahankan keseimbangan dalam tubuh (Price and Wilson, 2006). Kadar glukosa darah normal pada tikus Sprague Dawley ditunjukkan pada Tabel I. Kadar glukosa di dalam darah dimonitor oleh pankreas. Pankreas akan melepaskan glukagon, yaitu hormon yang menargetkan sel-sel di hati, bila kadar glukosa
(39)
menurun karena digunakan untuk memenuhi kebutuhan energi tubuh. Kemudian sel-sel tersebut mengubah glikogen menjadi glukosa (disebut glikogenolisis). Glukosa dilepaskan ke dalam aliran darah hingga meningkatkan kadar glukosa darah (Ignatavicius and Walkman, 2006).
Tabel I. Kadar Glukosa Darah Normal Tikus Sprague Dawley
Umur Satuan Jantan Betina
Purata + SD Purata + SD 6 minggu
mmol/l 6,7 + 0,4 6,4 + 0,7
12 minggu 7,7 + 2,5 8,5 + 3,4
(Anonim a, 2015) Glukosa dimetabolisme menjadi piruvat melalui jalur glikolisis, yang dapat terjadi secara anaerob, dengan produk akhir, yaitu laktat (Gambar 5). Jaringan aerobik memetabolisme piruvat menjadi asetil-KoA, yang dapat memasuki siklus asam sitrat untuk oksidasi sempurna menjadi CO2 dan H2O, berhubungan dengan pembentukan ATP dalam proses fosforilasi oksidatif (Murray, Granner and Rodwell, 2006).
Glukosa adalah satu-satunya nutrisi yang dalam keadaan normal dapat digunakan oleh otak, retina dan epitel germinal dari gonad. Kadar glukosa darah harus dijaga dalam konsentrasi yang cukup untuk menyediakan nutrisi bagi organ-organ tubuh. Namun sebaliknya, konsentrasi glukosa darah yang terlalu tinggi juga dapat memberikan dampak negatif seperti diuresis osmotik dan dehidrasi pada sel, Oleh karena itu, glukosa darah perlu dijaga dalam konsentrasi yang konstan. Insulin dan glukagon berfungsi sebagai sistem kontrol umpan balik yang penting dalam mempertahankan kadar glukosa darah. Ketika terjadi peningkatan kadar glukosa darah, insulin disekresikan. Sebaliknya, ketika terjadi penurunan kadar glukosa
(40)
darah, glukagon yang memiliki fungsi berlawanan dari insulin akan disekresikan (Guyton and Hall, 2006).
Gambar 5. Gambaran metabolisme glukosa (Murray et al, 2006)
Ada beberapa jenis pemeriksaan yang dilakukan terhadap glukosa darah, antara lain pemeriksaan kadar glukosa darah puasa (GDP), glukosa darah sewaktu (GDS) dan glukosa 2 jam setelah makan (PP = postprandial) (Darwis, 2005).
(41)
G. Keterangan Empiris
Penelitian ini merupakan penelitian eksploratif untuk mendapatkan bukti adanya efek toksisitas subakut dari infusa biji P. americana Mill. terhadap kadar glukosa dalam darah dan gambaran histopatologis pankreas tikus Sprague Dawley.
(42)
21
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan menggunakan rancangan penelitian acak lengkap pola searah. Pada penelitian ini hewan uji terbagi dalam 5 kelompok, di mana 1 kelompok terdiri atas 5 hewan uji. Kelompok I adalah kelompok yang diberi infusa biji P. americana Mill. dosis 202,24 mg/kg BB, kelompok II adalah kelompok yang diberi infusa biji P. americana Mill. dosis360 mg/kg BB, kelompok III adalah kelompok yang diberi infusa biji P. americana Mill. dosis 640,8 mg/kg BB, kelompok IV adalah kelompok yang diberi infusa biji P. americana Mill. dosis1140,6 mg/kg BB, dan kelompok V adalah kelompok kontrol negatif yang diberi aquadest 1142,86 mg/kg BB.
B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel utama
a. Variabel bebas : peringkat dosis infusa biji P. americana Mill.
b. Variabel terikat : kadar glukosa dalam darah dan histopatologis pankreas tikus
(43)
2. Variabel pengacau
a. Variabel pengacau terkendali
Hewan uji berupa tikus jantan dan betina galur Sprague Dawley
dengan berat badan 150-250 gram dan umur 2-3 bulan yang diperoleh dari Laboratorium Hayati Imono Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Bahan uji berupa biji P. americana Mill. yang mempunyai waktu panen, tempat tumbuh dan suhu yang sama. Frekuensi pemberian infusa satu kali 28 hari berturut-turut dengan waktu pemberian yang sama secara per oral. b. Variabel pengacau tak terkendali : kondisi patologis dan fisiologis
hewan uji dan hormon hewan uji betina. 3. Definisi operasional
a. Biji P. americana Mill. diambil dari tanaman P. americana Mill. yang berwarna kuning, segar, tidak bercacat dan dipanen pada saat tanaman sedang berbuah. Biji yang digunakan sudah dalam bentuk serbuk berwarna kecoklatan.
b. Infusa biji P. americana Mill. diperoleh dengan perebusan 8 g serbuk kering biji P. americana Mill. dalam 100 ml air pada suhu 90oC selama 15 menit, sehingga konsentrasi yang didapat yaitu sebesar 8% (b/v).
c. Dosis infusa biji P. americana Mill. adalah volume (ml) infusa biji P. americana Mill. tiap kg berat badan subjek uji yang digunakan.
d. Uji toksisitas subakut adalah uji toksisitas yang dilakukan selama 28 hari secara per oral.
(44)
e. Kadar glukosa dalam darah adalah jumlah glukosa (mg) dalam tiap satu desiliter (dl) darah hewan uji.
f. Parameter efek toksisitas subakut oleh biji P. americana Mill. adalah kadar glukosa darah dan gambaran histopatologis pankreas tikus yang diberi infusa biji P. americana Mill..
g. Sifat efek toksik yang mungkin muncul adalah terbalik atau tak terbalikkan.
C. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan pada penelitian ini, yaitu 25 tikus jantan dan 25 tikus betina galur Sprague Dawley dengan berat badan 150-250 g dengan umur 2-3 bulan yang diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Biji P. americana Mill. diperoleh dari depot Es Teler 77®, Galeria Mall, Yogyakarta pada Juni 2014.
Air Reverse Osmosis (RO) untuk asupan minum tikus, pelet AD-2 untuk asupan pakan tikus dan aquadest sebagai pelarut infusa.
Bahan untuk pemeriksaan histopatologis yaitu formalin 10% yang dibuat dengan mengencerkan formalin 30% dengan aquadest sesuai volume yang dikehendaki.
D. Alat Penelitian
1. Alat pembuatan serbuk kering biji P. americana Mill., yaitu timbangan digital,
oven, blender, ayakan Mesh 40, wadah untuk menyimpan serbuk. 2. Alat penetapan kadar air, yaitu sendok dan moisture balance.
(45)
3. Alat pembuatan infusa biji P. americana Mill., yaitu beaker glass, timbangan analitik, batang pengaduk, cawaan porselen, gelas ukur, panci enamelware, termometer, heater, stopwatch, kain flannel.
4. Alat uji toksisitas subakut infusa biji P. americana Mill., yaitu kandang tikus (metabolic cage), timbangan, beakerglass, jarum suntik peroral, spuit injeksi, eppendorf, pipa kapiler (haematokrit), mikroskop.
5. Alat perlakuan dan pemeriksaan histopatologis, yaitu kandang tikus (metabolic cage), seperangkat alat bedah, alat-alat gelas dan wadah penyimpan organ.
E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman
Biji P. americana Mill. berasal dari buah yang berwarna kuning, segar, tidak bercacat diambil dari Es Teler 77®, Galeria Mall, Yogyakarta. Determinasi dilakukan di Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
2. Pengumpulan biji P. americana Mill.
Bahan uji yang digunakan pada penelitian ini adalah biji P. americana Mill. yang diperoleh dari depot Es Teler 77®, Galeria Mall, Yogyakarta pada bulan Juni 2014.
3. Pembuatan serbuk biji P. americana Mill.
Biji P. americana Mill. dicuci bersih pada air mengalir. Kulit ari dari biji P. americana Mill. dibuang. Setelah bersih, biji dipotong tipis, kemudian
(46)
dikeringkan pada oven dengan suhu 50oC selama 72 jam. Setelah kering, biji dibuat serbuk dan diayak dengan ayakan Mesh 40.
4. Penetapan kadar air biji P. americana Mill.
Penetapan kadar air dilakukan menggunakan moisture balance. Serbuk biji sebanyak + 5 g dimasukkan ke dalam alat, diratakan dan dipanaskan pada suhu 105oC selama 15 menit. Kadar air biji P. americana
Mill. dinyatakan dalam presentase.
5. Pembuatan infusa biji P. americana Mill.
Serbuk biji P. americana Mill. yang kering ditimbang sebanyak 8 g. Kemudian serbuk kering tersebut dimasukkan dalam panci enamelware lalu ditambahkan aquadest dengan 2 kali bobot serbuk, yaitu 16 ml untuk membasahi serbuk kering tersebut. Lalu 100 ml aquadest dimasukkan ke dalam panci yang berisi serbuk yang telah dibasahi. Campuran tersebut dipanaskan di atas heater pada suhu 90oC selama 15 menit. Waktu 15 menit dihitung ketika suhu campuran mencapai 90oC. Setelah 15 menit, campuran tersebut diambil dan diperas menggunakan kain flannel lalu dimasukkan ke dalam labu ukur. Apabila infusa yang didapatkan belum tepat 100 ml maka ditambahkan dengan air panas melalui flannel tersebut.
6. Penetapan dosis infusa biji P. americana Mill.
Peringkat dosis infusa biji P. americana Mill. didasarkan pada pengobatan yang biasa digunakan oleh masyarakat, yaitu + 2 sendok makan (4 g) serbuk yang direbus dengan 250 ml air. Maka dosis perlakuan yang
(47)
digunakan adalah 4 g/70 kg BB manusia. Berdasarkan data di atas maka konversi dosis manusia 70 kg ke tikus 200 g = 0,018.
Dosis untuk tikus 200 g = 0,018 x 4 g – 0,72 g/200 g BB = 360 mg/kg BB Berdasarkan hasil orientasi infusa penelitian yang dilakukan oleh Yoseph (2013), konsentrasi maksimal infusa biji P. americana Mill. yang dapat dibuat adalah 8 g/100 ml dengan asumsi berat badan hewan uji maksimal adalah 350 g dan volume maksimal pemberian infusa secara p.o. = 5 ml.
Maka dilakukan perhitungan untuk menentukan dosis tinggi perlakuan dengan rumus : D x BB = C x V
D x 350 g = 8 g/100 ml x 5 ml D = 1142,86 mg/kg BB
Kemudian dihitung faktor kelipatan dari dosis rendah dan dosis tinggi untuk menentukan peringkat dosis :
√ � � � ����ℎ
−
= √ ,86
� �� ��
6 �� ��� = 1, (faktor kelipatan)
Dosis perlakuan yang digunakan dalam penelitian ini adalah dosis yang diperoleh dari uji toksisitas akut yang merupakan penelitian paralel. Dosis tertinggi pada uji toksisitas akut dijadikan sebagai dosis II pada uji toksisitas subakut ini, yaitu 360 mg/kg BB.
Berdasarkan faktor kelipatan yang diperoleh 4 peringkat dosis, yaitu : Dosis I : 360 mg/kg BB : 1,78 = 202,24 mg/kg BB Dosis II : 360 mg/kg BB
(48)
Dosis III : 360 mg/kg BB x 1,78 = 640,8 mg/kg BB Dosis IV : 640,8 mg/kg BB x 1,78 = 1140,6 mg/kg BB 7. Penetapan dosis aquadest sebagai kontrol negatif
Untuk menentukan dosis aquadest sebagai kontrol negatif maka digunakan rumus : D x BB = C x V
D x 350 g BB = 1 g/ml x 5 ml
D = 5 g/350g BB
= 0,014285 g/g BB = 14.285 mg/kg BB 8. Penyiapan dan pemeliharaan hewan uji
Hewan uji yang digunakan berjumlah 50 ekor tikus (25 ekor jantan dan 25 ekor betina) dari galur Sprague Dawley yang ditempatkan dalam
metabolic cage. Pada setiap metabolic cage ditempatkan satu tikus sesuai kelompok dosis, jantan dan betina dipisahkan. Sebelum perlakuan hewan uji diadaptasikan dengan lingkungan selama 3 hari.
Hewan uji diberikan asupan pakan berupa pelet AD-2 setiap hari sebanyak 30 g selama 28 hari masa perlakuan dan 14 hari masa uji reversibilitas. Hewan uji diberikan minum berupa air reverse osmosis (RO) setiap hari sebanyak 100 ml selama 28 hari masa perlakuan dan 14 hari masa perlakuan reversibilitas. Penelitian ini telah mendapatkan Ethical Clearance
dari Komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta (Lampiran 10).
(49)
9. Pengelompokkan dan prosedur pelaksanaan toksisitas subakut
Lima puluh ekor tikus dibagi secara acak menjadi 5 kelompok, tiap kelompok terdapat 5 ekor tikus jantan dan 5 ekor tikus betina. Kelompok I sampai kelompok IV diberi perlakuan infusa biji P. americana Mill. dengan peringkat dosis berturut-turut yaitu 202,24; 360; 640,8 dan 1140,6 mg/kg BB. Kelompok V adalah kelompok kontrol negatif yang diberi aquadest dengan dosis 1142,86 mg/kg BB.
Uji toksisitas subakut dilakukan dengan cara pemberian infusa biji
P. americana Mill. satu kali sehari selama 28 hari pada hewan uji sesuai dosis pemberian di mana tikus tetap diberi makan dan minum. Pada hari ke-1, semua tikus yang sudah dipuasakan selama 5 jam diambil darahnya melalui sinus orbital mata dan ditampung pada eppendorf, lalu dilakukan pengukuran kadar glukosa dalam darah di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu UGM, Yogyakarta. Pada hari ke-29, dibuat perlakuan yang sama seperti hari pertama. Setelah itu dilanjutkan dengan pembedahan pada sebagian dari jumlah hewan uji dan dilihat histopatologis pankreas. Hewan uji yang tersisa dipelihara selama 14 hari tanpa diberi perlakuan infusa biji P. americana Mill. untuk melihat sifat efek toksik terbalikkan (reversible)atau tak terbalikkan (irreversible). Pada hari ke-15 dilakukan pembedahan terhadap hewan uji.
10. Prosedur pemusnahan hewan percobaan
Sebelum pembedahan, hewan uji dikorbankan dengan cara anestetika overdose, yakni memasukkan tikus ke dalam wadah tertutup berisi
(50)
eter yang akan diinhalasi oleh tikus. Setelah dibedah caesar dengan membuat irisan di garis tengah ventral tubuh, kemudian diambil organ yang diinginkan, yaitu pankreas dengan menggunakan pinset dan gunting bedah. Pankreas dicuci bersih dengn NaCl 0,9% kemudan difiksasi dan dimasukkan ke dalam wadah berisi formalin 10% untuk diawetkan. Hewan uji yang sudah diambil organnya, dimasukkan ke dalam kantong plastik dan dibungkus lagi dengan kertas, diletakkan di dalam tas plastik, ditutup dan dikubur di halaman laboratorium.
11. Pembuatan preparat histopatologis
Organ yang disimpan dalam wadah berisi formalin 10% dilakukan
trimming, yaitu pemotongan tipis jaringan setebal kurang lebih 4 mm dengan orientasai sesuai dengan organ yang akan dipotong. Potongan jaringan dimasukkan dalam embedding cassette dan dilanjutkan dengan dehidrasi menggunakan tissue processor untuk mengeluarkan air yang terkandung dalam jaringan. Dehidrasi menggunakan cairan dehidran, seperti etanol atau isopropil alkohol. Cairan dehidran kemudian dibersihkan dari dalam jaringan dengan menggunakan reagen pembersih, yaitu xilol selama 1 jam, yang kemudian diganti dengan parafin dengan metode penetrasi ke dalam jaringan selama 2 jam. Setelah melalui proses dehidrasi, maka jaringan yang berada dalam embedding cassette dipindahkan ke dalam base mold yang diisi dengan parafin cair. Jaringan kemudian dipotong dengan menggunakan mikrotom, lalu dilakukan pewarnaan. Karena preparat yang diinginkan untuk pemeriksaan rutin, dipergunakan teknik pewarnaan Harris
(51)
hematoksilin-eosin. Setelah jaringan pada preparat diwarnai, kaca preparat ditutup dengan
coverglass (Carson, 1990).
12. Pengamatan uji toksisitas subakut a. Penimbangan berat badan hewan uji
Purata perubahan berat badan tiap kelompok hewan uji dihitung pada hari ke-0, 7, 14, 21 dan 28. Data dianalisis secara statistik
General Linier Model (metode multivariate). b. Pengukuran asupan pakan hewan uji
Asupan pakan hewan uji berupa 30 g pelet AD-2 yang diberikan setiap hari. Cara mengukur besarnya asupan makan tikus yaitu dengan menimbang pakan yang diberikan pada hari pertama dan pakan yang masih tertinggal di wadah pada hari kedua. Selisih penimbangan antara berat pakan hari pertama dengan berat pakan hari kedua, dihitung sebagai asupan makanan yang dihabiskan pada hari pertama.
c. Pengukuran asupan minum hewan uji
Asupan minum berupa 100 ml air reverse osmosis (RO) yang diberikan setiap hari. Minuman diberikan dalam wadah botol berskala dengan pipa yang diberi lubang pada ujungnya. Air minum yang dihabiskan tikus pada hari pertama dihitung dengan cara mengurangkan jumlah air minum yang diberikan pada hari pertama dengan jumlah air minum sisa pada hari kedua. Selisih pengukuran antara volume minum
(52)
hari pertama dengan volume minum hari kedua dihitung sebagai asupan minum yang dihabiskan pada hari pertama.
F. Tata Cara Analisis Hasil 1. Pengamatan berat badan hewan uji
Data perubahan berat badan merupakan data pendukung yang didapat dengan menghitung rata-rata kenaikan berat badan pada hari ke-0, 7, 14, 21 dan 28. Data perubahan berat badan dianalisis menggunakan General Linier Model
(metode multivariate).
2. Pengukuran asupan pakan hewan uji
Data asupan pakan dianalisis dengan menghitung purata pakan yang dihabiskan setiap kelompok hewan uji per harinya, kemudian dibuat grafik perubahan pola makan hewan uji.
3. Pengukuran asupan minum hewan uji
Data asupan minum dianalisis dengan menghitung purata minuman yang dihabiskan setiap kelompok hewan uji per harinya, kemudian dibuat grafik perubahan pola minum hewan uji.
4. Analisis kadar glukosa dalam darah hewan uji
Dilakukan uji Paired-T test untuk melihat perbedaan antar waktu sebelum dan sesudah perlakuan. Data hasil pengukuran kadar glukosa dianalisis dengan menggunakan uji Kolmogorov Smirnov untuk melihat distribusi data tiap kelompok. Apabila distribusi data normal maka dilanjutkan dengan analisis pola searah (One Way ANOVA) dengan taraf kepercayaan 95% untuk mengetahui
(53)
perbedaan masing-masing kelompok. Jika terdapat perbedaan bermaksna (p<0,05) maka dilanjutkan dengan uji Scheffe untuk mengetahui perbedaan antar kelompok. Apabila data hasil analisis dengan uji Kolmogorov Smirnov
menunjukkan distribusi yang tidak normal maka dilanjutkan dengan analisis non parametrik, yaitu uji Kruskal Walls untuk mengetahui perbedaan kadar glukosa antar kelompok. Kemudian dilanjutkan dengan uji Mann Whitney untuk mengetahui perbedaan uji tiap kelompok.
5. Pengamatan histopatologis hewan uji
Pembacaan preparat dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya (Olympus DP 10®) di Laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Perubahan struktural histopatologis pankreas yang diamati meliputi pengamatan kualitatif pada morfologi pankreas yang dibandingkan dengan perlakuan pada kontrol negatif. Hasil pembacaan disajikan dalam bentuk analisis deskriptif dan foto mikroskopis.
(54)
G. Skema Alur Penelitian
Keterangan : IBPAM = Infusa biji P. americana Mill.
50 ekor tikus (25 jantan dan 25 betina) masing-masing dibagi ke dalam 5 kelompok
Hewan uji ditempatkan dalam metabolic cage secara acak dan diadaptasikan selama 3 hari sebelum memulai perlakuan
Sebelum hari-1, hewan uji ditimbang dan dipuasakan selama 5 jam sebelum pengambilan darah
Dilakukan pengambilan darah (pre perlakuan)
Hewan uji dikembalikan dalam metabolic cage
Hewan uji diberi IBPAM secara peroral empat jam setelah pengambilan darah dan diberi asupan pakan selama 28 hari dengan waktu pemberian yang sama
Kel. I IBPAM 202,4 mg/kg BB Kel. II IBPAM 360 mg/kg BB Kel. III IBPAM 640,8 mg/kg BB Kel. IV IBPAM 1140,6 mg/kg BB Kel. Kontrol Aquadest 14285 mg/kg BB
Dilakukan pengukuran asupan pakan, minum dan pengamatan berat badan selama 28 hari setiap pagi
Pada hari ke-29, hewan uji ditimbang dan dipuasakan kembali selama 5 jam sebelum pengambilan darah
3 hewan uji dikorbankan dan dilakukan pembedahan serta pengamatan histopatologis organ pankreas
Dilakukan pengambilan darah (post perlakuan)
2 hewan uji sisanya dibiarkan hidup tanpa pemberian IBPAM maupun aquadest selama 14 hari untuk uji reversibilitas
Pada hari ke-15, hewan uji yang tersisa pada saat uji reversibilitas dikorbankan dan dilakukan pembedahan serta pengamatan histopatologis organ pankreas
(55)
34
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan pemberian infusa biji P. americana Mill. secara subakut memiliki efek toksik pada tikus Sprague Dawley
yang dilihat dari perubahan biokimia berupa kadar glukosa dalam darah dan perubahan struktural berupa gambaran histopatologis pankreas. Selain itu untuk mengetahui hubungan kekerabatan antara dosis infusa biji P. americana Mill. dengan efek toksik subakut pada kadar glukosa dan histopatologis pankreas tikus, serta untuk mengetahui sifat efek toksik dari histopatologis pankreas tikus.
A. Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman bertujuan untuk memastikan bahwa biji yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji P. americana Mill., sehingga tidak terjadi kesalahan dalam penyiapan bahan yang akan digunakan. Determinasi dilakukan di Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta (Lampiran 8). Hasil determinasi menunjukkan bahwa biji yang digunakan dalam penelitian ini adalah benar biji P. americana Mill. varietas hijau panjang menyerupai buah pir.
B. Serbuk dan Kadar Air Serbuk Biji P. americana Mill.
Penetapan kadar air bertujuan untuk mengetahui banyaknya air yang terkandung dalam serbuk yang digunakan dalam pembuatan infusa. Serbuk yang
(56)
baik dapat terpenuhi bila kadar airnya masuk dalam persyaratan yang telah ditentukan Farmakope Indonesia IV yaitu kurang dari 10%. Penetapan kadar air ini penting untuk dilakukan karena air merupakan habitat yang disukai mikroorganisme untuk dapat berkembangbiak dan melangsungkan hidupnya. Jika kadar air dalam serbuk lebih dari 10% sangat memungkinkan mikroorganisme hidup di dalamnya dan mencemari serbuk tersebut sehingga tidak layak digunakan sebagai bahan uji percobaan.
Penetapan kadar air serbuk biji P. americana Mill. menggunakan metode gravimetri dengan alat moisture balance. Dari hasil penetapan kadar air serbuk tersebut, didapatkan purata kadar air serbuk biji P. americana Mill. sebesar 5,63% sehingga dapat dikatakan telah memenuhi syarat serbuk yang baik.
C. Pengaruh Pemberian Infusa Biji P. americana Mill. Terhadap Kadar Glukosa Darah Tikus
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk membuktikan pemberian infusa biji
P. americana Mill. secara subakut memiliki efek toksik pada tikus Sprague Dawley
terhadap perubahan biokimia berupa kadar glukosa dalam darah, sehingga dilakukanlah pemeriksaan terhadap kadar glukosa darah. Pemeriksaan kadar glukosa darah dilakukan sebelum (pre) dan sesudah (post) pemberian infusa biji P. americana Mill. selama 28 hari. Tujuan pemeriksaan sebelum perlakuan adalah untuk mengetahui kadar glukosa darah sebelum perlakuan dan kemungkinan adanya kondisi patologis yang terkait dengan fungsi pankreas. Pemeriksaan sesudah perlakuan bertujuan untuk melihat kebermaknaan perbedaan kadar glukosa darah yang dibandingkan dengan sebelum perlakuan. Dari hasil pemeriksaan
(57)
tersebut, kemudian dianalisis menggunakan Paired T-test, karena uji yang digunakan sama namun memiliki perlakuan yang berbeda dan untuk melihat apakah terdapat pengaruh pemberian infusa biji P. americana Mill. yang bermakna pada sebelum dan sesudah perlakuan di tiap kelompok perlakuan. Pemeriksaan dilanjutkan dengan uji One Way ANOVA pada data kadar glukosa darah tikus sesudah pemberian infusa biji P. americana Mill. selama 28 hari.
Pengukuran kadar glukosa darah menggunakan metode enzimatik, GOD-PAP (GOD = glucose oxidase; PAP = phenol + aminophenazone). Prinsip dari metode ini, yaitu enzim glukosa oksidase mengkatalis reaksi oksidasi glukosa menjadi glukonolakton dan hidrogen peroksida. Pengukuran kadar glukosa darah pada penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Dalam penelitian ini terdapat lima kelompok perlakuan, yaitu kelompok perlakuan infusa biji P. americana Mill. dosis 202,24; 360; 640,8; 1.140,6 mg/kg BB dan kelompok kontrol negatif aquadest dosis 14.285 mg/kg BB. Pelarut yang digunakan pada infusa biji P. americana Mill. adalah aquadest. Kelompok kontrol digunakan aquadest bertujuan untuk melihat apakah aquadest sebagai pelarut infusa biji P. americana Mill. dapat memberikan pengaruh terhadap kadar glukosa darah. Hasil uji Paired T-test pada Tabel II menunjukkan bahwa nilai p>0,05, artinya purata kadar glukosa darah tikus jantan pada sebelum (pre) dan sesudah (post) perlakuan dari semua kelompok perlakuan adalah berbeda tidak bermakna. Dengan demikian, dapat dikatakan bahwa pemberian infusa biji P. americana Mill. menimbulkan pengaruh yang tidak bermakna pada kadar glukosa darah post
(58)
perlakuan yang dibandingkan dengan pre perlakuan. Selanjutnya, kadar glukosa darah post pemberian infusa biji P. americana Mill. selama 28 hari dianalisis menggunakan uji One Way ANOVA. Tujuannya adalah untuk melihat ada tidaknya pengaruh pemberian infusa biji P. americana Mill. pada kelompok perlakuan infusa biji P. americana Mill. yang dibandingkan terhadap kelompok perlakuan kontrol aquadest. Hasil menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang tidak bermakna antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol negatif post perlakuan (Gambar 7), yaitu dilihat dari nilai p sebesar 0,901 (p>0,05). Menurut Anonim (2015), kadar glukosa darah normal pada tikus jantan dengan umur 12 minggu berkisar antara 102,7 – 127,9 mg/dl. Oleh karena itu, pemberian infusa biji P. americana Mill. secara subakut tidak mempengaruhi kadar glukosa darah tikus jantan sehingga dapat disimpulkan bahwa tidak terdapat kekerabatan antara efek toksik subakut dengan dosis infusa biji P. americana Mill..
Tabel II. Purata + SE kadar glukosa darah pemberian infusa biji P. americana
Mill. pada tikus jantan serta nilai p kadar glukosa tiap kelompok
Kelompok Dosis
(mg/kg BB) N
Kadar Glukosa (mg/dl)
Nilai p Pre
(Mean+SE)
Post
(Mean+SE)
I IBPAM
202,24 5 115,76+2,65 93,92+3,21 0,233 BTB
II IBPAM
360 5 113,38+3,40 97,64+2,88 0,202 BTB
III IBPAM
640,8 5 91,62+5,64 97,38+6,33 0,513 BTB
IV IBPAM
1.140,6 5 106,58+4,24 98,08+1,47 0,422 BTB V Aquadest
14.285,7 5 107,32+6,54 98,70+2,59 0,140 BTB
Keterangan : SE = Standard Error
IBPAM = Infusa biji P. americana Mill.
Pre = sebelum pemberian IBPAM
Post = sesudah pemberian IBPAM BTB = berbeda tidak bermakna (p>0,05)
(59)
Gambar 7. Diagram batang purata kadar glukosa darah tikus jantan antar kelompok perlakuan akibat pemberian infusa biji P. americana Mill.
Selain pada tikus jantan, pemeriksaan kadar glukosa darah dilakukan juga pada tikus betina. Perlakuan yang diberikan pada tikus jantan, diterapkan sama pada tikus betina, yaitu dilakukan sebelum dan sesudah pemberian infusa biji P. americana Mill. selama 28 hari dan dilakukan uji Paired T-test. Analisis dilanjutkan dengan One Way ANOVA.
Hasil uji Paired T-test pada Tabel III menunjukkan bahwa nilai p>0,05, artinya purata kadar glukosa darah tikus betina pada sebelum dan sesudah perlakuan dari semua kelompok perlakuan adalah berbeda tidak bermakna sehingga dinyatakan bahwa pemberian infusa biji P. americana Mill. selama 28 hari tidak mempengaruhi kadar glukosa darah tikus betina.
(60)
Tabel III. Purata + SE kadar glukosa darah pemberian infusa biji P. americana
Mill. pada tikus betina serta nilai p kadar glukosa tiap kelompok
Kelompok Dosis
(mg/kg BB) N
Kadar Glukosa (mg/dl)
Nilai p Pre
(Mean+SE)
Post
(Mean+SE)
I IBPAM
202,24 5 101,18+28,40 95,24+16,72 0,866 BTB
II IBPAM
360 5 109,04+4,73 82,32+10,90 0,652 BTB
III IBPAM
640,8 5 114,04+7,22 95,74+4,77 0,133 BTB
IV IBPAM
1.140,6 5 104,20+12,39 97,88+11,38 0,536 BTB V Aquadest
14.285,7 5 106,24+15,33 84,18+11,15 0,123 BTB
Keterangan : SE = Standard Error
IBPAM = Infusa biji P. americana Mill.
Pre = sebelum pemberian IBPAM
Post = sesudah pemberian IBPAM BTB = berbeda tidak bermakna (p>0,05)
Gambar 8. Diagram batang purata kadar glukosa darah tikus betina antar kelompok perlakuan akibat pemberian infusa biji P. americana Mill.
(61)
Selanjutnya kadar glukosa darah post tikus betina dianalisis dengan uji
One Way ANOVA. Hasil menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang tidak bermakna antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol negatif post
penelitian (Gambar 8), yaitu dilihat dari nilai p sebesar 0,143 (p>0,05). Menurut Anonim (2015), kadar glukosa darah normal pada tikus betina dengan umur 12 minggu berkisar antara 91,9 – 214,4 mg/dl. Pemberian infusa biji P. americana
Mill. secara subakut tidak mempengaruhi kadar glukosa darah tikus betina sehingga dapat disimpulkan bahwa tidak terdapat kekerabatan antara efek toksik subakut dengan dosis infusa biji P. americana Mill.. Untuk melihat efek toksik yang lebih jelas, dapat dilakukan uji toksisitas subkronis infusa biji P. americana Mill. terhadap tikus selama lebih dari 28 hari.
D. Pengaruh Pemberian Infusa Biji P. americana Mill. Terhadap Gambaran Histopatologis Pankreas Tikus
Pemeriksaan histopatologis bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya perubahan struktural pada pankreas tikus jantan dan betina sebagai wujud efek toksik subakut akibat pemberian infusa biji P. americana Mill. selama 28 hari. Hasil pemeriksaan histopatologis pankreas kelompok perlakuan dibandingkan dengan kontrol untuk melihat spektrum efek toksik yang terjadi. Pankreas dapat diduga mengalami kerusakan jika terdapat perbedaan gambaran histopatologis antara kelompok perlakuan dan kontrol.
(62)
Tabel IV. Presentase hasil pemeriksaan histopatologis pankreas tikus masa perlakuan
Dosis (mg/kg BB)
Presentase Perubahan Histopatologis (%) Jantan (n=3) Betina (n=3)
IBPAM 202,24 0 0
IBPAM 360 0 0
IBPAM 640,8 0 0
IBPAM 1.140,6 0 0
Aquadest 14.285,7 0 0
Keterangan : IBPAM = Infusa biji P. americana Mill.
Hasil pemeriksaan histopatologis pankreas tikus jantan maupun betina (Tabel IV) menunjukkan bahwa tidak ada perubahan spesifik yang teramati pada organ pankreas. Kelompok perlakuan infusa biji P. americana Mill. dan kontrol aquadest menunjukkan tidak adanya kerusakan, baik pada sel asinus pankreas eksokrin dan kepulauan Langerhans pankreas endokrin.
Gambar 9. Pulau Langerhans normal (Aquadest 14.285,7 mg/kg BB) [Pewarna Hematoxyline -Eosin, perbesaran 400x]
(63)
Gambar 10. Pulau Langerhans normal (Infusa biji P. americana Mill. 1.140,6 mg/kg BB) [Pewarna Hematoxyline-Eosin, perbesaran 400x]
Pada Gambar 9 merupakan hasil pemeriksaan histopatologis pankreas tikus dengan kepulauan Langerhans dari kelompok kontrol dalam keadaan normal, begitu pula pada kelompok perlakuan (Gambar 10) dengan empat peringkat dosis. Berdasarkan hasil pemeriksaan histopatologis pankreas dari semua kelompok perlakuan maupun kelompok kontrol tidak terdapat perubahan struktural pada pankreas akibat pemberian infusa biji P. americana Mill. selama 28 hari perlakuan, sehingga dapat disimpulkan bahwa pemberian infusa biji P. americana Mill. tidak menimbulkan efek toksik. Gambaran histopatologis pankreas yaang normal di mana anatomi dan struktur pulau Langerhans terlihat normal ditandai dengan terdistribusinya sel-sel Langerhans secara homogen di seluruh bagian pulau. Menurut Kuehnel (2003), kepulauan Langerhans terdiri dari beberapa sel penghasil hormon endokrin, di antaranya sel alfa (α), sel beta (β), sel delta (δ) dan sel PP (polipeptida pankreas). Pada preparat memperlihatkan sebaran sel-sel β berada di
(64)
tengah kepulauan Langerhans, sedangkan sel-sel lainnya seperti sel α, sel δ dan sel PP tersebar di bagian tepi pulau membentuk mantel. Anatomi kepulauan Langerhans yang normal menunjukkan hubungannya dengan pemeriksaan kadar glukosa darah di mana menunjukkan hasil yang berbeda tidak bermakna ketika diberikan infusa biji P. americana Mill..
E. Uji Reversibilitas
Setelah dilakukan perlakuan selama 28 hari, penelitian dilanjutkan dengan uji reversibilitas selama 14 hari. Uji reversibilitas dilakukan untuk mengetahui keterbalikan efek toksik pada organ pankreas yang terjadi setelah bahan uji tidak diberikan, sehingga dapat melihat sifat efek toksik yang muncul setelah dilakukan penghentian pemberian infusa biji P. americana Mill., apakah terbalikkan atau tak terbalikkan. Disebut terbalikkan jika kerusakan yang terjadi pada suatu organ dapat pulih kembali pada kondisi normal karena adanya perbaikan sel dan jaringan pada organ tersebut, sehingga dapat berfungsi kembali sebagaimana mestinya. Disebut tak terbalikkan jika kerusakan struktural yang terjadi pada suatu organ tidak kembali menjadi kondisi normal. Sifat efek toksik dilihat dengan membandingkan hasil pemeriksaan histopatologis uji reversibilitas dengan masa perlakuan.
Hasil uji reversibilitas (Tabel V) pada tikus betina menunjukkan bahwa organ pankreas dalam keadaan normal, baik pada kelompok kontrol (Gambar 11) maupun pada kelompok perlakuan (Gambar 12) dengan empat peringkat dosis. Berbeda dengan betina, pada uji reversibilitas tikus jantan terdapat nekrosis sel di kepulauan Langerhans yang terjadi pada kelompok perlakuan infusa biji P.
(1)
ANOVA Kadar_Glukosa
Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 1048.042 4 262.011 1.941 .143 Within Groups 2699.788 20 134.989
(2)
Lampiran 15. Analisis statistik berat badan tikus jantan
Case Processing Summary Cases
Included Excluded Total
N Percent N Percent N Percent BB0 * Kelompok 25 100.0% 0 .0% 25 100.0% BB7 * Kelompok 25 100.0% 0 .0% 25 100.0% BB14 * Kelompok 25 100.0% 0 .0% 25 100.0% BB21 * Kelompok 25 100.0% 0 .0% 25 100.0% BB28 * Kelompok 25 100.0% 0 .0% 25 100.0%
Report
Kelompok BB0 BB7 BB14 BB21 BB28
Dosis 1 N 5 5 5 5 5
Mean 178.8000 185.0000 193.4000 220.2000 239.0000 Std. Error of Mean 7.64461 12.07891 16.91626 11.15975 9.38083 Std. Deviation 17.09386 27.00926 37.82592 24.95396 20.97618
Dosis 2 N 5 5 5 5 5
Mean 199.8000 202.8000 210.8000 238.4000 262.2000 Std. Error of Mean 9.62497 12.11776 14.61985 12.11033 12.19590 Std. Deviation 21.52208 27.09613 32.69098 27.07951 27.27086
Dosis 3 N 5 5 5 5 5
Mean 154.8000 195.0000 228.8000 255.0000 271.4000 Std. Error of Mean 1.85472 7.15542 5.13225 11.66190 9.06973 Std. Deviation 4.14729 16.00000 11.47606 26.07681 20.28053
Dosis 4 N 5 5 5 5 5
Mean 198.6000 214.2000 220.6000 242.4000 259.0000 Std. Error of Mean 12.20492 8.83403 10.56220 9.03659 10.39711 Std. Deviation 27.29102 19.75348 23.61779 20.20643 23.24866
Kontrol N 5 5 5 5 5
Mean 192.8000 192.2000 193.2000 216.6000 221.6000 Std. Error of Mean 13.89028 8.20610 6.61362 6.17738 20.22029 Std. Deviation 31.05962 18.34939 14.78851 13.81304 45.21394
Total N 25 25 25 25 25
Mean 184.9600 197.8400 209.3600 234.5200 250.6400 Std. Error of Mean 5.32368 4.52242 5.58894 5.10788 6.42725 Std. Deviation 26.61841 22.61209 27.94471 25.53938 32.13627
(3)
Between-Subjects Factors Value Label N Kelompok 1.00 Dosis 1 5
2.00 Dosis 2 5 3.00 Dosis 3 5 4.00 Dosis 4 5 5.00 Kontrol 5
Multivariate Testsc
Effect Value F Hypothesis df Error df Sig.
Intercept Pillai's Trace .993 464.086a 5.000 16.000 .000 Wilks' Lambda .007 464.086a 5.000 16.000 .000 Hotelling's Trace 145.027 464.086a 5.000 16.000 .000 Roy's Largest Root 145.027 464.086a 5.000 16.000 .000 Kelompok Pillai's Trace 1.100 1.441 20.000 76.000 .130 Wilks' Lambda .169 1.915 20.000 54.016 .030 Hotelling's Trace 3.461 2.509 20.000 58.000 .003 Roy's Largest Root 3.041 11.557b 5.000 19.000 .000 a. Exact statistic
b. The statistic is an upper bound on F that yields a lower bound on the significance level. c. Design: Intercept + Kelompok
Levene's Test of Equality of Error Variancesa
F df1 df2 Sig.
Berat badan hari ke-0 3,680 4 20 ,021 Berat badan hari ke-7 ,168 4 20 ,952 Berat badan hari ke-14 ,795 4 20 ,542 Berat badan hari ke-21 ,768 4 20 ,559 Berat badan hari ke-28 1,474 4 20 ,247 Tests the null hypothesis that the error variance of the dependent variable is equal across groups.
(4)
Lampiran 16. Analisis statistik berat badan tikus betina
Case Processing Summary Cases
Included Excluded Total
N Percent N Percent N Percent BB0 * Kelompok 25 100.0% 0 .0% 25 100.0% BB7 * Kelompok 25 100.0% 0 .0% 25 100.0% BB14 * Kelompok 25 100.0% 0 .0% 25 100.0% BB21 * Kelompok 25 100.0% 0 .0% 25 100.0% BB28 * Kelompok 25 100.0% 0 .0% 25 100.0%
Report
Kelompok BB0 BB7 BB14 BB21 BB28
Dosis 1 N 5 5 5 5 5
Mean 173.2000 186.4000 173.0000 184.4000 199.0000 Std. Error of Mean 6.80000 15.64800 7.72658 8.11542 7.58288 Std. Deviation 15.20526 34.99000 17.27715 18.14663 16.95582
Dosis 2 N 5 5 5 5 5
Mean 153.4000 156.4000 148.0000 159.4000 173.6000 Std. Error of Mean 11.19643 2.15870 6.33246 5.58211 5.95483 Std. Deviation 25.03597 4.82701 14.15980 12.48199 13.31540
Dosis 3 N 5 5 5 5 5
Mean 171.2000 157.4000 161.2000 174.8000 188.2000 Std. Error of Mean 8.85099 11.44814 12.20410 11.05622 11.35077 Std. Deviation 19.79141 25.59883 27.28919 24.72246 25.38110
Dosis 4 N 5 5 5 5 5
Mean 157.2000 158.8000 169.8000 162.6000 167.8000 Std. Error of Mean 1.39284 3.21559 6.39844 3.10805 5.03389 Std. Deviation 3.11448 7.19027 14.30734 6.94982 11.25611
Kontrol N 5 5 5 5 5
Mean 150.8000 151.8000 154.4000 157.8000 170.0000 Std. Error of Mean 1.06771 7.51266 4.73920 9.80000 7.54983 Std. Deviation 2.38747 16.79881 10.59717 21.91347 16.88194
Total N 25 25 25 25 25
Mean 161.1600 162.1600 161.2800 167.8000 179.7200 Std. Error of Mean 3.46539 4.61110 3.74412 3.89658 4.01477 Std. Deviation 17.32695 23.05551 18.72058 19.48290 20.07386
(5)
Between-Subjects Factors Value Label N Kelompok 1.00 Dosis 1 5
2.00 Dosis 2 5 3.00 Dosis 3 5 4.00 Dosis 4 5 5.00 Kontrol 5
Multivariate Testsc
Effect Value F Hypothesis df Error df Sig.
Intercept Pillai's Trace .997 1009.785a 5.000 16.000 .000 Wilks' Lambda .003 1009.785a 5.000 16.000 .000 Hotelling's Trace 315.558 1009.785a 5.000 16.000 .000 Roy's Largest Root 315.558 1009.785a 5.000 16.000 .000 Kelompok Pillai's Trace 1.373 1.987 20.000 76.000 .017 Wilks' Lambda .134 2.246 20.000 54.016 .010 Hotelling's Trace 3.216 2.332 20.000 58.000 .006 Roy's Largest Root 2.008 7.629b 5.000 19.000 .000 a. Exact statistic
b. The statistic is an upper bound on F that yields a lower bound on the significance level. c. Design: Intercept + Kelompok
Levene's Test of Equality of Error Variancesa
F df1 df2 Sig.
BB0 10,282 4 20 ,000
BB7 2,865 4 20 ,050
BB14 1,478 4 20 ,246
BB21 1,490 4 20 ,243
BB28 1,607 4 20 ,211
Tests the null hypothesis that the error variance of the dependent variable is equal across groups.
(6)