34
memasukkan nyamuk ke dalam lemari es, dan dimasukkan dalam tabung ependrof tersebut, dihancurkan sampai halus dengan alat pellet pestle. Selanjutnya ke dalam
tabung ependrof tersebut dimasukkan 75 μl Triton-X 5 dan didiamkan selama 30
menit pada suhu 4°C. Homogenat disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 4 menit. Tabung efendrof yang berisi homogenat diletakkan kembali di
atas hancuran es, kemudian supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam tabung efendrof baru. Supernatan ditambahkan 1 tetes indikator bromophenol blue dan
dimasukkan dalam sumuran. Sebelumnya cetakan gel dipasang terlebih dahulu pada tempat elektroda.
6. Elektroforesis
Larutan penyangga dituang pada ruang bagian atas dan bawah tempat elektroda. Larutan penyangga di bagian atas harus menutupi seluruh permukaan
sumuran gel atas yang telah berisi homogenat. Elektroforesis dilakukan kira-kira selama 2,5 jam pada tegangan 120 volt, kuat arus 30 mA, pada ruang dengan
temperatur 4°C. Elektroforesis dianggap sudah cukup, bila mobilitas buffer penanda telah melewati 70-90 panjang gel. Setelah selesai, gel diambil dengan
memisahkannya dari lempeng kaca dan dilanjutkan dengan proses pengecatan.
7. Pengecatan
Larutan substrat terdiri atas 20 mg α-naftil asetat dan 2 ml aseton. Untuk
pencucian digunakan larutan penyangga 0,1 M buffer fosfat, pH 6,8 sebanyak 50 ml. Pada akhir elektroforesis gel dicuci dengan buffer fosfat selama 5 menit untuk
menurunkan nilai pH. Selanjutnya buffer pencuci diganti dengan buffer fosfat PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
yang baru 25 ml untuk inkubasi. Larutan substrat dimasukkan dan ditutup rapat- rapat. Inkubasi dilakukan dengan kondisi temperatur ruang antara 20-30°C selama
10 menit, sambil kadang-kadang digoyang. Untuk pengecatan digunakan larutan yang terdiri atas akuades 10 ml,
garam Fast Blue B sebanyak 45 mg dan 0,2 M buffer fosfat pH 6,8 sebanyak 10 ml. Pada akhir inkubasi, larutan substrat dibuang dan larutan untuk pengecatan
dimasukkan dan inkubasi dilanjutkan kembali. Setelah gambaran pola esterase non-spesifik terbentuk dengan jelas dan baik, larutan untuk pengecatan dibuang
dan gel dicuci dengan air beberapa kali sampai bersih untuk menghentikan reaksi. Gel segera difoto untuk mendapatkan gambar yang baik.
F. Analisis Hasil
Zymogram yang terbentuk dianalisis secara kualitatif. Analisis secara kualitatif dilakukan dengan membandingkan intensitas warna pola pita antara
nyamuk subjek penelitian atau nyamuk uji dengan kontrol dan dilakukan juga analisis dengan menghitung kecepatan gerak jarak esterase dalam medan listrik,
dihitung harga Rf-nya dengan rumus:
= Rf
awal titik
dari penanda
pewarna migrasi
Jarak awal
titik dari
protein pita
Jarak
serta dianalisis juga dengan menggunakan tes Chi-square untuk mengetahui frekuensi elektromorf.
