33
4. Penyiapan gel atas
Gel atas dibuat pada hari berikutnya setelah gel bawah selesai dipersiapkan. Komposisi gel atas dengan menggunakan 5 akrilamida 0,617 M
Tris-HCl pH 6,7 adalah seperti yang tercantum pada Tabel II. Larutan b, d, e dan akuades dicampur dalam botol vakum atau beker glass
atau Erlenmeyer dan dilakukan diaerasi menggunakan pompa vakum. Larutan ditambah TEMED, dan dengan hati-hati digojog, selanjutnya dituang ke atas gel
bawah setelah akuades di atasnya diambil. Sisir plastik dimasukkan dalam gel atas untuk membuat sumuran tempat sampel. Bila polimerasi sudah terjadi dengan
sempurna gel atas tampak putih, selanjutnya sisir plastik diambil dan kelebihan akuades yang ada dalam masing-masing sumuran dibersihkan menggunakan
syringe.
Tabel II. Jumlah bahan yang digunakan dalam pembuatan gel atas Banyaknya yang dibutuhkan untuk volume
Bahan 6,5 ml
13 ml
Larutan b Larutan d
Akuades Larutan e
Diaerasi TEMED
0,78 ml 2,60 ml
2,09 ml 1,03 ml
4,70 μl
1,56 ml 5,20 ml
4,18 ml 2,06 ml
9,40 μl
5. Penyiapan homogenat nyamuk
Tabung ependrof diletakkan di atas hancuran es batu, kemudian ditetesi 75 μl sukrosa 20. Nyamuk secara individual dimatikan lebih dahulu dengan cara
34
memasukkan nyamuk ke dalam lemari es, dan dimasukkan dalam tabung ependrof tersebut, dihancurkan sampai halus dengan alat pellet pestle. Selanjutnya ke dalam
tabung ependrof tersebut dimasukkan 75 μl Triton-X 5 dan didiamkan selama 30
menit pada suhu 4°C. Homogenat disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 4 menit. Tabung efendrof yang berisi homogenat diletakkan kembali di
atas hancuran es, kemudian supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam tabung efendrof baru. Supernatan ditambahkan 1 tetes indikator bromophenol blue dan
dimasukkan dalam sumuran. Sebelumnya cetakan gel dipasang terlebih dahulu pada tempat elektroda.
6. Elektroforesis
Larutan penyangga dituang pada ruang bagian atas dan bawah tempat elektroda. Larutan penyangga di bagian atas harus menutupi seluruh permukaan
sumuran gel atas yang telah berisi homogenat. Elektroforesis dilakukan kira-kira selama 2,5 jam pada tegangan 120 volt, kuat arus 30 mA, pada ruang dengan
temperatur 4°C. Elektroforesis dianggap sudah cukup, bila mobilitas buffer penanda telah melewati 70-90 panjang gel. Setelah selesai, gel diambil dengan
memisahkannya dari lempeng kaca dan dilanjutkan dengan proses pengecatan.
7. Pengecatan
Larutan substrat terdiri atas 20 mg α-naftil asetat dan 2 ml aseton. Untuk
pencucian digunakan larutan penyangga 0,1 M buffer fosfat, pH 6,8 sebanyak 50 ml. Pada akhir elektroforesis gel dicuci dengan buffer fosfat selama 5 menit untuk
menurunkan nilai pH. Selanjutnya buffer pencuci diganti dengan buffer fosfat PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Kategori