Jenis dan Rancangan Penelitian Tata Cara Analisis Hasil

24

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan penelitian acak lengkap pola searah.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel utama

a. Variabel bebas, yaitu variasi dosis jangka pendek pemberian ekstrak etanol kulit buah P. americana pada tikus jantan terinduksi karbon tetraklorida. b. Variabel tergantung, yaitu kadar albumin pada tikus jantan galur Wistar yang terinduksi karbon tetraklorida setelah pemberian jangka pendek ekstrak etanol kulit buah P. americana.

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali, antaralain kondisi hewan uji, yaitu tikus galur Wistar berjenis kelamin jantan, umur 2-3 bulan dan mempunyai berat badan 150-250g, frekuensi pemberian ekstrak etanol kulit buah P. americana selama 6 jam, cara pemberian hepatotoksin secara intraperitoneal i.p, bahan uji yang digunakan berupa kulit buah P. americana. b. Variabel pengacau tak terkendali, yaitu kondisi patologis dari hewan uji.

3. Definisi Operasional

a. Kulit buah P. americana. Kulit buah P. americana berwarna hijau, segar dan tidak bercacat yang diambil dari buah P. americana. b. Ekstrak etanol kulit buah P. americana. Ektrak etanol kulit buah P. americana merupakan ekstrak kental dari serbuk kering kulit P. americana seberat 40,0 g yang dilarutkan dalam 200 mL pelarut etanol secara maserasi selama 5x24 jam dengan sesekali penggojogan, hasil maserasi kemudian disaring menggunakan corong Buchner yang dilapisi kertas saring, sehingga diperoleh filtrat. Serbuk sisa perendaman diremaserasi kembali dengan pelarut etanol 70 kemudian dimaserasi selama 2 hari dengan sesekali penggojogan, selanjutnya disaring, dievaporasi, diuapkan di atas waterbath selama 12 jam pada suhu 80 C hingga bobot tetap. c. Bobot tetap. Penimbangan telah mencapai bobot tetap apabila perbedaan dua kali penimbangan berturut-turut setelah diuapkan di atas waterbath selama 1 jam konstan atau tidak melebihi 0,0005 g pada timbangan. d. Dosis efektif. Dosis minimum dari ekstrak etanol kulit buah P. americana yang dapat meningkatkan kadar albumin dan memberikan hasil berbeda bermakna dengan kelompok kontrol hepatotoksin karbon tetraklorida 2mLkg BB. e. Peningkatan albumin. Kemampuan ekstrak etanol kulit buah P. amercina dalam meningkatkan kadar albumin dibandingkan dengan kontrol hepatotoksin karbon tetraklorida. f. Pemberian jangka pendek. Pemberian ekstrak etanol kulit buah P. americana kepada hewan uji dengan waktu 6 jam sebelum pemberian karbon tetraklorida.

C. Bahan Penelitian

1. Bahan utama

a. Hewan uji yang digunakan adalah tikus jantan galur Wistar berumur 2-3 bulan dengan berat badan 150-250g yang diperoleh dari Laboratorium Imunologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. b. Bahan uji yang digunakan adalah serbuk kering kulit buah P. americana yang diperoleh dari daerah depot es Teller 77 di Yogyakarta pada bulan Juni 2014.

2. Bahan kimia

a. Karbon tetraklorida yang digunakan sebagai hepatotoksin diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. b. Etanol teknis pelarut ekstrak diperoleh dari toko bahan kimia Genera Labora Yogyakarta. c. Olive oil Bertolli® d. Bahan pelarut aquadest diperoleh dari Laboratorium Kimia Organik Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. e. Natrium-Carboxymethyl Cellulosa CMC-Na sebagai pelarut ekstrak kental kulit buah P. americana yang diperoleh dari Laboratorium Biofarmasetika Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. f. Blanko pada pengukuran aktivitas ALT-AST serum menggunakan aquabidestilata yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis dan Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta g. Reagen DyaSyss untuk mengukur aktivitas serum ALT dan AST. h. Reagen serum albumin

D. Alat Penelitian

1. Alat ektraksi

Alat-alat gelas yang meliputi gelas ukur, labu ukur, cawan porselen, Erlenmeyer, Bekker glass, corong Buchner, batang pengaduk, pipet tetes, ayakan No. 40 Electric Sieve Shaker, timbangan analitik Mettler Toledo ® , rotary vacuum evaporator IKAVAC ®,

2. Alat uji hepatoprotektif

Alat-alat gelas yang meliputi Bekker glass, tabung reaksi, batang pengaduk, gelas ukur, pipet tetes. Timbangan elektrik, spuit per oral, syringe 3 cc Terumo® dan, pipa kapiler, tabung Eppendorf.

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman

P. americana

Determinasi dilakukan dengan mencocokkan tanaman P. americana yang diperoleh dari depot es Teller 77 di Yogyakarta dengan tanaman P. americana yangterdapat dalam buku acuan Agrilink. Tujuan dilakukannya determinasi yaitu untuk memastikan bahwa serbuk yang digunakan dalam penelitian ini merupakan tanaman P. americana. Determinasi ini dilakukan di Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

2. Pengumpulan bahan uji

Bahan uji yang digunakan adalah kulit buah P. americana yang masih segar dan tidak busuk yang diperoleh dari depot es Teller 77 di Yogyakarta pada Juni 2014.

3. Pembuatan serbuk

P. americana

Serbuk kulit buah P. americana diambil dari depot es Teller 77 pada bulan Juni 2014, kemudian dibersihkan kulitnya dan dipisahkan dari bijinya sambil dicuci di bawah air mengalir, tujuannya untuk membersihkan kulit dari kotoran. Kulit yang masih bagus dan segar yang akan digunakan, dipotong menjadi ukuran yang lebih kecil serta diangin-anginkan. Jika sudah tidak terlalu basah maka kemudian dikeringkan ke dalam oven selama 24 jam dengan suhu 50 C. Kulit yang sudah kering lalu dihaluskan dengan mesin penyerbuk sehingga diperoleh serbuk kulit P. americana. Untuk memperoleh ukuran yang homogen maka serbuk yang sudah diperoleh diayak dengan ayakan no.40 supaya mendapatkan luas permukaan yang lebih besar sehingga lebih mudah larut.

4. Penetapan kadar air dalam serbuk kering kulit buah

P. americana

Penetapan kadar air serbuk kulit buah P. americana bertujuan untuk mengetahui kadar air dalam serbuk dan untuk memenuhi persyaratan serbuk yang baik, yaitu kurang dari 10 Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995. Penetapan kadar air serbuk kulit buah P. americana dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu, Universitas Gajah Mada dengan metode gravimetri.

5. Pembuatan sediaan etanol kulit buah

P. americana

Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi. Sebanyak 40 g serbuk kulit buah P. americana direndam dalam 200 mL pelarut etanol 70 dimaserasi pada suhu kamar selama 5 x 24 jam sesekali dilakukan penggojogan. Setelah dilakukan perendaman, hasil maserasi kemudian disaring menggunakan corong Buchner yang dilapisi kertas saring sehingga diperoleh filtrat. Serbuk sisa perendaman dimaserasi kembali dengan 200 mL etanol 70 selama 2 x 24 jam sesekali dilakukan penggojogan. Filtrat hasil saringan dipindahan ke labu alas bulat untuk dievaporasi untuk menguapkan cairan penyari pada proses maserasi. Hasil evaporasi dituangkan dalam cawan porselen yang telah ditimbang sebelumnya agar mempermudah perhitungan rendemen ekstrak yang akan diperoleh. Cawan porselen yang berisi larutan hasil evaporasi digunakan di atas waterbath dengan suhu 80 C untuk mendapatkan ekstrak etanol kulit buah P. amerciana dengan bobot pengeringan ekstrak yang tetap, yang bertujuan untuk menghitung sisa zat setelah dilakukan pengeringan. Ekstrak yang diperoleh ditimbang setiap satu jam sampai memperoleh bobot yang konstan. Berat tetap digunakan sebagai batasan akan seberapa banyak senyawa yang hilang selama proses pengeringan yang nantinya akan berpengaruh pada konsentrasi serta dosis ekstrak. Ekstrak kemudian disimpan di dalam desikator, dan dilakukan perhitungan rata-rata rendemen enam replikasi ekstrak etanol kulit buah P. americana kental yang telah dibuat. Rata-rata rendemen = ��� 1+��� 2+��� 3+⋯+��� 8+��� 9+��� 10 10 Rendemen ektrak = ����−���� �������� ����� ��������� x 100

6. Pembuatan

suspending agent CMC-Na 1 Pembuatan CMC-Na 1 dilakukan dengan ditimbang saksama sebanyak 1 gram CMC-Na ke dalam air sampai volume 100,0 mL kemudian didiamkan selama 24 jam.

7. Penetapan konsentrasi ekstrak

Konsentrasi ekstrak yang digunakan yaitu konsentrasi pekat, yang mana pada konsentrasi tersebut tersebut ekstrak dapat dimasukkan serta dikeluarkan dari spuit oral yang digunakan. Mengacu pada penelitian Nopitasari 2013, konsentrasi ekstrak di dapat dengan melarutkan sebanyak 3,5 g dalam labu ukur 50 mL dengan pelarut yang sesuai yaitu CMC-Na 1 sehingga konsentrasi ekstrak dapat ditetapkan sebesar 7 bv atau 0,07 grammL atau 70 mgmL.

8. Penetapan dosis ekstrak etanol kulit buah

P. amerciana

Tikus dengan bobot tertinggi 250 mg digunakan untuk perhitungan penetapan peringkat dosis, konsentrasi dan pemberian setengah volume cairan peroral yaitu 5 mL serta konsentrasi ektrak kulit buah P. americana yang dapat dimasukkan dan dikeluarkan melalui spuit oral yaitu 7 atau 70 mgmL, berdasarkan penelitian Nopitasari 2013 maka penetapan dosis tertinggi ekstrak diperoleh sebagai berikut : BB x D = C x V 0,250 kg x D = 70 mgmL x 5 mL  D= 1400 mgkg BB Dosis tengah dan dosis rendah ditentukan dengan menurunkan dua dan empat kalinya dari dosis tertinggi, sehingga diperoleh dosis 700 dan 350 mgKg BB. Dosis yang digunakan 350, 700, dan 1400 mgkg BB.

9. Pembuatan suspensi karbon tetraklorida 50

Suspensi karbon tetraklorida dibuat dalam konsentrasi 50 dengan perbandingan 1:1 yaitu melarutkan 50mL karbon tetraklorida ke dalam olive oil sebanyak 50 mL Janakat dan Merrie, 2002.

10. Uji pendahuluan

a. Penetapan dosis hepatotoksin karbon tetraklorida. Penetapan dosis hepatoksin ini dilakukan dengan melakukan studi literatur terlebih dahulu. Dosis hepatoksin yang digunakan dalam penelitian ini mengacu berdasar penelitian Janakat dan Merie 2002, yang membuktikan bahwa dosis karbon tetraklorida yang menyebabkan hepatotoksik yaitu dosis 2 mLkg BB secara intraperitoneal i.p. Dosis hepatotoksin di atas ditentukan berdasarkan parameter ALT. Penelitian Mahmud, Bachar serta Qais 2012melaporkan bahwa pada tikus yang telah terinduksi karbon tetraklorida secara intraperitoneal i.p, menunjukkan adanya peningkatan ALT yang diikuti dengan penurunan kadar albumin. Pada tikus terinduksi karbon tetraklorida maka aktivitas ALT dan AST akan meningkat, dan juga kadar albumin pada tikus tersebut akan menurun Ahmed, Alam, Varshney, Khan, 2002. Penelitian Sivakrishnan, Kottaimuthu 2014 juga menunjukkan bahwa aktivitas ALT dan AST meningkat dan juga kadar albumin akan menurun namun dalam hal ini tikus terinduksi hepatotoksin parasetamol. Tujuan dilakukannya penetapan dosis dari karbon tetraklorida ini yakni mengetahui pada dosis berapa hepatotoksin karbon tetraklorida dapat menimbulkan kerusakan hati ditunjukkan dengan adanya penurunan kadar albumin tetapi tidak menimbulkan kematian pada hewan uji.. b. Penetapan waktu cuplikan darah. Untuk menetapkan waktu pencuplikan darah dilakukan orientasi dengan satu kelompok. Dalam satu kelompok terdiri dari 8 ekor tikus. Pengambilan darah dilakukan melalui sinus orbitalis mata. Pada jam ke 0, 24, dan 48 jam setelah pemejanan karbon tetraklorida, setelah itu diukur aktivitas ALT nya, dari pengukuran aktivitas ALT ini bisa menjadi acuan untuk pengukuran albumin. Penelitian Janakat dan Merie 2002 menunjukkan bahwa pada jam ke-24 setelah pemberian hepatoksin karbon tetraklorida mencapai aktivitas ALT serum maksimal kemudian pada jam ke-48 akan mulai menurun aktivitasnya.

11. Pengelompokkan hewan uji

Tiga puluh ekor tikus dibagi ke dalam enam kelompok perlakuan secara acak dengan masing-masing sebanyak 5 ekor tikus. a. Kelompok I kontrol hepatotoksin yang diberi larutan karbon tetraklorida : olive oil 1:1 dengan dosis 2 mLkgBB secara i.p. b. Kelompok II kontrol negatif diberi diberi olive oil dengan dosis 2 mLkg BB secara i.p. c. Kelompok III kontrol ekstrak diberi ekstrak etanol kulit buah P. americana dosis 1,4 gkg BB secara peroral enam jam sebelum pengambilan darah d. Kelompok IV dosis rendah diberi ekstrak etanol kulit buah P.americana dengan dosis 0,35 gkg BB secara peroral enam jam sebelum diberi hepatotoksin karbon tetraklorida e. Kelompok V dosis tengah diberi ekstrak etanol kulit buah P. americana dengan dosis 0,70 gkg BB secara peroral enam jam sebelum diberi hepatotoksin karbon tetraklorida f. Kelompok VI dosis tinggi diberi ekstrak etanol kulit buah P. americana dengan dosis 1,4 gkg BB secara peroral enam jam sebelum diberi hepatotoksin karbon tetraklorida Setelah 6 jam pemberian ekstrak etanol kulit buah P.americana , maka kelompok IV-VI dipejani dengan karbon tetraklorida dosis 2 mLkg BB secara i.p, lalu setelah 24 jam diambil darahnya melalui sinus orbitalis mata, kemudian dilakukan pengukuran kadar serum albumin.

12. Pengambilan darah

Pengambilan darah dilakukan pada bagian sinus orbitalis mata tikus lalu ditampung dalam tabung khusus dan kemudian diserahkan ke Laboratorium Parahita, Yogyakarta.

13. Pengukuran kadar albumin

Pengukuran kadar albumin serum dilakukan di Laboratorium Parahita, Yogyakarta. Kadar albumin dinyatakan dengan satuan mgdL. Kadar albumin normal pada tikus yaitu 3,0 – 3,5 mgdL Trisnarizki, 2007.

F. Tata Cara Analisis Hasil

Data kadar serum albumin dianalisis dengan Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui normalitas data pada masing-masing kelompok perlakuan. Nilai normal suatu data ditunjukkan dengan nilai p0,05. Apabila hasil analisis statistik Kolmogorov-Smirnov kadar serum albumin menunjukkan distribusi data normal p0,05, dilanjutkan dengan analisis One Way Anova dengan taraf kepercayaan 95 untuk mengetahui perbedaan masing-masing kelompok. Apabila hasil tersebut menunjukkan nilai signifikansi p0,05, berarti data tersebut homogen. Kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe untuk mengetahui kebermaknaan perbedaan antar kelompok. 35

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Tujuan dari penelitian ini untuk mengetahui pengaruh pemberian jangka pendek ekstrak etanol kulit buah P. americana pada tikus jantan galur Wistar yang terinduksi karbon tetraklorida dilihat dari kadar albumin yang diperoleh. Tujuan tersebut dapat tercapai dengan dilakukan serangkaian pengujian.

A. Hasil Determinasi Tanaman

Determinasi terhadap tanaman P. americana bertujuan untuk membuktikan bahwa tanaman yang digunakan pada penelitian adalah benar P. americana supaya nantinya tidak terjadi kesalahan dalam penyiapan bahan. Bagian tanaman yang digunakan dalam determinasi antara lain biji dan buahnya. Cara melakukan determinasi ini yaitu dengan mencocokkan kesamaan ciri kulit buah P. americana yang digunakan dalam penelitian dengan kulit buah P. americana dalam buku acuan Agrilink. Hasil yang diperoleh membuktikan bahwa serbuk yang digunakan dalam penelitian adalah benar kulit buah P. americana.

B. Hasil Penimbangan Bobot Ekstrak Etanol Kulit Buah

P. americana

Pemilihan pelarut yang akan digunakan didasarkan pada jenis kandungan zat aktif sehingga ada kecocokan antara zat aktif dengan larutan penyari. Pelarut yang digunakan yaitu etanol yang mempunyai kemampuan menyari dengan polaritas yang lebar mulai dari senyawa non polar sampai pelarut polar, sehingga dikenal bahwa