14 memberikan hasil yang lebih kuat dibandingkan dengan analisis protein karena
analisis DNA mitokondria dapat mendeteksi semua keragaman genetik yang bernilai bagi pemahaman identifikasi stok Ferris dan Berg 1987, diacu dalam
Rina 2001. Hal ini dapat dilihat dari perbandingan hasil-hasil penelitian dengan menggunakan DNA mitokondria dan analisis protein pada ikan-ikan American
oyster Crassostrera virginica, kepiting Limulus polyphemus, ikan teleostei laut
Fundulus heteroclitus dan Theragra chalcogramma ikan teleostei air tawar Stizestedion vitreum serta ikan anadromus American shad Alosa sapidissima
yang menyimpulkan bahwa sub divisi populasi lebih besar terlihat pada analisis dengan DNA mitokondria dibandingkan dengan protein Ward dan Grewe 1995,
diacu dalam Rina 2001.
Daerah D-loop atau dikenal juga dengan nama daerah kontrol control region
merupakan bagian dari DNA mitokondria yang sangat spesifik. Analisis DNA mitokondria pada D-loop telah digunakan untuk menduga keragaman
genetik dan struktur populasi ikan japanese flounder Paralichthys alovaceus oleh Fujii dan Nishida 1997.
2.4 RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
RFLP adalah suatu metode untuk melihat perbedaan profil dan panjang DNA yang dipotong dengan enzim restriksi endonuklease yang sama tetapi pada
individu yang berbeda dalam suatu populasi Stansfield 1991, diacu dalam Ayu 2005. Metode RFLP digunakan untuk mengetahui polimorfisme DNA pada
wilayah tertentu dengan melihat tipe atau pola pemotongan DNA dengan menggunakan bantuan enzim restriksi Sianipar 2003.
RFLP atau dalam Bahasa Indonesia dikenal dengan istilah fragmen restriksi yang polimorfik merupakan penanda molekul yang pertama kali ditemukan dan
digunakan. Penggunaannya dimungkinkan semenjak orang menemukan enzim endonuklease restriksi RE, suatu kelas enzim yang mampu mengenal dan
memotong seurutan pendek basa DNA biasanya 4-6 urutan basa. RFLP bersifat kodominan dan cukup berlimpah serta polimorfik. Penanda ini juga mudah
dipetakan dalam peta genetik dan bersifat stabil Anonim 2008d.
15 Suatu fragmen restriksi yang polimorfik RFLP akan muncul apabila DNA
dari individu yang berbeda dalam populasi memberikan profil fragmen yang berbeda saat DNA-nya terpotong menggunakan enzim restriksi endonuklease
yang sama Stansfield 1991, diacu dalam Sunandar 2008. RFLP telah digunakan pada genom mitokondria di beberapa situs restriksi antara lain 16S rRNA
ribosomal ribonucleic acid dan CO cytochrome oxidase-I Mathews et al. 2002, diacu dalam Sunandar 2008 dan area D-loop Nugroho et al. 2002.
Penelitian Bouchon et al. 1994 diacu dalam Rina 2001 memperlihatkan bahwa analisis mtDNA dengan RFLP telah dapat memperlihatkan variasi DNA
pada dua spesies udang penaeid Penaeus monodon Fab dan P. japonicus Bate. Selain itu, Tabata dan Mizuta 1997 diacu dalam Rina 2001 melakukan
penelitian untuk mendapatkan hasil yang lebih rinci pada populasi ikan red sea bream
Pagrus major dengan analisis RFLP mtDNA pada daerah D-loop.
2.5 Polymerase Chain Reaction PCR
PCR atau dalam Bahasa Indonesia dikenal dengan istilah reaksi berantai polimerase merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan replikasi DNA
secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, orang dapat menghasilkan DNA dalam jumlah besar dalam waktu singkat sehingga
memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA Anonim 2009a. Erlich 1989 diacu dalam Rina 2001 menyatakan bahwa PCR adalah sebuah
metode in vitro yang digunakan untuk mensintesa sekuen DNA tertentu secara enzimatis dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridasi
pita yang berlawanan dan mengapit daerah target DNA. Metode PCR terdiri dari tiga tahap utama, yaitu 1 tahap denaturasi
denaturation untuk memisahkan DNA menjadi utas tunggal single strand pada suhu 95
o
C, 2 tahap penempelan annealing merupakan proses penempelan primer DNA baru pada utas tunggal yang telah terpisah dan 3 tahap
pengembangan extension yang merupakan proses pemanjangan utas DNA yang baru Baker dan Birt 2000, diacu dalam Sunandar 2008. Lisdiyanti 1997
mengemukakan bahwa PCR adalah metode yang sangat sensitif sehingga hanya
16 dengan satu molekul DNA, dapat diperbanyak dua kali lipat DNA dalam satu
siklus suhu denaturation, annealing dan extension. Sekuens primer DNA merupakan faktor kunci yang menentukan berhasil
atau tidaknya suatu PCR, karena primer ini sebagai awal dimulainya proses amplifikasi DNA. Jika primer langsung menempel pada susunan basa nukleotida
pada sekuens DNA, maka proses berikutnya akan mudah bekerja dengan baik. umumnya suatu primer DNA memiliki panjang antara 20-24 pasangan basa
basepairs, baik primer yang berukuran panjang atau pendek keduanya umum digunakan dalam proses PCR Baker dan Birt 2000, diacu dalam Sunandar 2008.
Primer DNA yang digunakan sebaiknya memiliki kesamaan sekuens atau spesifik dengan target template DNA
2.6 Keragaman Genetik
