21 Pelaksanaan analisis sampel dilaksanakan pada bulan Oktober-November
2008 di Laboratorium Genetika Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar Bogor.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian adalah sampel potongan- potongan sirip ekor ikan tuna mata besar Thunnus obesus.
Alat yang dipakai dalam pengambilan sampel sirip meliputi: meteran, timbangan, pisau, botol sampel dan alat-alat tulis. Bahan dan alat yang digunakan
dalam penelitian sampel di laboratorium antara lain taq ready to go, agarose gel, TBE buffer
, 100 bp base pairs ladder marker, loading dye, tube 1.500 μl, tube
600 μl, tip 10 μl, tip 100 μl, tip 1.000 μl, larutan proteinase kinase, ethidium
bromide , primer Pro-5 CAC GAC GTT GTA AAA CGA CCT ACC YCY AAC
TCC CAA AGC, dan primer 12SAR GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGG CAT AGT GGG GTA TCT AAT CC, serta enzim-enzim TaqI, Afa I, Mbo I dan
Hin6 I .
3.3 Metode Penelitian
3.3.1 Penentuan Sampel
Ikan uji atau sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah tuna mata besar yang tertangkap oleh kapal tuna longline dari Samudera Hindia sebelah
selatan Jawa dan Nusa Tenggara dan didaratkan di Benoa, Bali. Sampel diambil dari 5 kapal contoh tuna longline yang diikuti. Ikan sampel yang diambil bagian
sirip ekornya diukur panjang dan beratnya, kemudian dicatat lokasi tertangkapnya. Sirip ekor ikan sampel dipotong bagian ujungnya Gambar 5, kemudian
potongan sirip dimasukan ke dalam botol sampel yang sebelumnya telah dicuci dan diisi dengan larutan alkohol analis absolut sebagai pengawet. Botol sampel
yang telah terisi sirip ekor kemudian ditutup rapat dan diberi label. Label tersebut berupa nomor urut dari setiap ikan sampel. Pengumpulan contoh spesimen dan
data lapangan dibantu oleh tenaga lapang yang telah ditunjuk.
22
Gambar 5 Pemotongan sirip ekor untuk sampel genetik.
3.3.2 Ekstraksi DNA
DNA ikan diekstraksi dari potongan sirip dengan menggunakan metode sebagai berikut :
Sebanyak 5-10 mg potongan sirip ikan dimasukkan ke dalam mikrotube 1,5 ml yang telah berisi 500
μl larutan urea. Adapun komposisi larutan urea terdiri dari :
Urea :
48,048 gr
NaCl :
1,461 gr
1 molar tris pH 7,5 : 2 ml
10 SDS : 10 ml
Bahan-bahan tersebut diencerkan dengan aquades sampai 200 ml, lalu disaring. Kemudian ke dalam mikrotube ditambahkan 10
μl proteinase kinase 20 mgml, diaduk dengan menggunakan vortex, lalu disimpan dalam inkubator
waterbath selama 3-24 jam pada suhu 37
o
C. Setelah inkubasi selesai, ke dalam mikrotube ditambahkan 500
μl equilibrated phenol, kemudian diaduk kembali dengan menggunakan vortex. Setelah itu disentrifuse dengan kecepatan
10.000 rpm selama 10 menit. Lapisan supernatant yang terbentuk di lapisan atas diambil dengan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam mikrotube
baru. Setelah itu ditambahkan 10
μl CH
3
COONa dan 1.000 μl etanol 90. Jika
setelah pengadukan terlihat benang-benang putih, kemungkinan besar sudah
23 terdapat DNA. Selanjutnya larutan yang diperoleh disentrifuse dengan kecepatan
10.000 rpm selama 10 menit sampai terbentuk endapan putih pellet. Jika pellet belum terbentuk, maka harus disentrifuse kembali dengan kecepatan 12.000 rpm
selama 5 menit. Setelah pellet terbentuk, larutan di atasnya dibuang. Kemudian pellet
dikeringkan pada suhu ruangan dan ditambahkan 100 μl DNA rehydration
solution . Hasil ekstraksi selanjutnya disimpan pada suhu 4
o
C sebelum digunakan pada tahap selanjutnya.
3.3.3 Amplifikasi Daerah mtDNA
