Pembuatan Kultur Slide Harrigan 1998 Identifikasi Isolat Kapang

1. Isolasi Kapang dan Khamir Daulay 1989

Sebanyak 5 g ragi tape berbentuk bubuk ditambah dengan 45 ml akuades steril, setelah itu dilakukan pengenceran 10 -2, 10 -3 , 10 -4 dan seterusnya. Selanjutnya dilakukan pemupukan cawan sebanyak 1 ml suspensi ragi tape, kemudian 15 ml medium APDA PDA+asam tartarat 10 dituang ke dalam cawan dan diratakan, setelah itu diinkubasi selama 2-3 hari pada suhu 28-30 o C. Setiap koloni kapang dan khamir yang berbeda warna dan penampilannya dipisahkan dan dimurnikan, selanjutnya digores kembali pada PDA miring dan disimpan di kulkas sebagai kultur stok.

2. Identifikasi Kapang dari Ragi Tape

a. Pembuatan Kultur Slide Harrigan 1998

Untuk membuat kultur slide dibutuhkan cawan petri yang di dalamnya terdapat gelas obyek yang diletakkan di atas batang U atau V, perangkat tersebut berada dalam keadaan steril. Potongan medium PDA steril berukuran 1x1 cm diletakkan di atas gelas obyek yang berada di dalam cawan petri, selanjutnya dilakukan inokulasi kapang pada potongan agar tepat di tengah-tengah keempat sisinya menggunakan jarum ose. Potongan agar yang telah diinokulasi kemudian ditutup dengan cover glass. Akuades steril diteteskan ke dalam cawan petri tanpa membasahi gelas obyek yang ada di dalamnya, selanjutnya kultur slide diinkubasi pada suhu 28-30 o C sekitar 2-4 hari. Bila spora telah muncul, cover glass diangkat dan diletakkan pada gelas obyek lain yang telah diberi cairan pewarna lactophenol cotton blue, kemudian struktur kapang diamati di bawah mikroskop. Gambar 4 Diagram alir tahap penelitian Koleksi sampel ragi tape Jakarta, Bandung, Semarang, Rembang, Yogyakarta, Madiun Isolasi Kapang dan Khamir Persiapan Spora

A. parasiticus

Seleksi Isolat Kapang dan Khamir dengan Aktivitas Reduksi Aflatoksin terbaik Uji Kemampuan Isolat Kapang dan Khamir untuk Mereduksi Kandungan Aflatoksin Uji Kemampuan Penghambatan Kapang Khamir thd Pertumbuhan A. parasiticus 1. Perhitungan koloni CFUml 2. Karakteristik morfologi 3. Interaksi Langsung antara Khamir dgn A. parasiticus Uji Pengaruh Filtrat KapangKhamir terhadap Biosintesis Aflatoksin 1. Pengukuran Berat Kering Miselium 2. Analisis Aflatoksin 3. Pengukuran pH Uji Kemampuan KapangKhamir dalam Mendegradasi Aflatoksin 1. Analisis Aflatoksin 2. Pengukuran pH Identifikasi Kapang dan Khamir Pembuatan Kultur Stok

b. Identifikasi Isolat Kapang

Identifikasi isolat kapang dilakukan baik secara makroskopis maupun mikroskopis. Identifikasi secara makroskopis dilakukan dengan cara melihat langsung koloni yang tumbuh pada media CYA, MEA dan G25N setelah 2 hari inkubasi pada suhu 28-30 o C. Koloni yang tumbuh akan memiliki spora dengan bentuk dan warna yang berbeda-beda tergantung spesies kapang, sedangkan identifikasi secara mikroskopis dilakukan dengan cara mengamati struktur kapang di bawah mikroskop setelah sebelumnya ditumbuhkan terlebih dahulu pada kultur slide selama 3 hari. Identifikasi spesies kapang ditentukan dengan membandingkan ciri-ciri makroskopis dan mikroskopis kapang tersebut dengan ciri-ciri kapang yang terdapat pada pustaka. Berdasarkan kunci identifikasi Pitt dan Hocking 1997, penggolongan Ordo Mucorales ke dalam genus berdasarkan pada morfologi sporangiofor dan sporangium Lampiran 3. Penggolongan Rhizopus dan Mucor ke dalam spesies berdasarkan kunci identifikasi Gilman 1957 di mana penggolongan Mucor ke dalam spesies berdasarkan ukuran sporangium dan sporangiospora, warna hifa serta suhu optimum pertumbuhan Lampiran 4, sedangkan penggolongan Rhizopus ke dalam spesies berdasarkan perkembangan rhizoid, ukuran spora dan sporangiofor Lampiran 5. Deskripsi Chlamydomucor oryzae berdasarkan Heyne 1987 dan penggolongan Aspergillus ke dalam spesies berdasarkan warnapigmentasi konidia Raper dan Fennell 1973 Lampiran 6. Konfirmasi beberapa spesies kapang dilakukan di Laboratorium Fitopatologi, SEAMEO BIOTROP Bogor.

3. Identifikasi Khamir