1. Isolasi Kapang dan Khamir Daulay 1989
Sebanyak 5 g ragi tape berbentuk bubuk ditambah dengan 45 ml akuades steril, setelah itu dilakukan pengenceran 10
-2,
10
-3
, 10
-4
dan seterusnya. Selanjutnya dilakukan pemupukan cawan sebanyak 1 ml
suspensi ragi tape, kemudian 15 ml medium APDA PDA+asam tartarat 10 dituang ke dalam cawan dan diratakan, setelah itu diinkubasi selama
2-3 hari pada suhu 28-30
o
C. Setiap koloni kapang dan khamir yang berbeda warna dan penampilannya dipisahkan dan dimurnikan,
selanjutnya digores kembali pada PDA miring dan disimpan di kulkas sebagai kultur stok.
2. Identifikasi Kapang dari Ragi Tape
a. Pembuatan Kultur Slide Harrigan 1998
Untuk membuat kultur slide dibutuhkan cawan petri yang di dalamnya terdapat gelas obyek yang diletakkan di atas batang U atau
V, perangkat tersebut berada dalam keadaan steril. Potongan medium PDA steril berukuran 1x1 cm diletakkan di atas gelas obyek yang
berada di dalam cawan petri, selanjutnya dilakukan inokulasi kapang pada potongan agar tepat di tengah-tengah keempat sisinya
menggunakan jarum ose. Potongan agar yang telah diinokulasi kemudian ditutup dengan
cover glass. Akuades steril diteteskan ke dalam cawan petri tanpa membasahi gelas obyek yang ada di dalamnya, selanjutnya kultur slide
diinkubasi pada suhu 28-30
o
C sekitar 2-4 hari. Bila spora telah muncul, cover glass diangkat dan diletakkan pada gelas obyek lain
yang telah diberi cairan pewarna lactophenol cotton blue, kemudian struktur kapang diamati di bawah mikroskop.
Gambar 4 Diagram alir tahap penelitian Koleksi sampel ragi tape
Jakarta, Bandung, Semarang, Rembang,
Yogyakarta, Madiun
Isolasi Kapang dan Khamir Persiapan Spora
A. parasiticus
Seleksi Isolat Kapang dan Khamir dengan Aktivitas Reduksi Aflatoksin terbaik Uji Kemampuan Isolat Kapang dan Khamir untuk Mereduksi Kandungan Aflatoksin
Uji Kemampuan Penghambatan Kapang Khamir thd Pertumbuhan
A. parasiticus 1. Perhitungan koloni CFUml
2. Karakteristik morfologi 3. Interaksi Langsung antara
Khamir dgn A. parasiticus Uji Pengaruh Filtrat KapangKhamir
terhadap Biosintesis Aflatoksin 1. Pengukuran Berat Kering Miselium
2. Analisis Aflatoksin 3. Pengukuran pH
Uji Kemampuan KapangKhamir dalam Mendegradasi Aflatoksin
1. Analisis Aflatoksin 2. Pengukuran pH
Identifikasi Kapang dan Khamir
Pembuatan Kultur Stok
b. Identifikasi Isolat Kapang
Identifikasi isolat kapang dilakukan baik secara makroskopis maupun mikroskopis. Identifikasi secara makroskopis dilakukan
dengan cara melihat langsung koloni yang tumbuh pada media CYA, MEA dan G25N setelah 2 hari inkubasi pada suhu 28-30
o
C. Koloni yang tumbuh akan memiliki spora dengan bentuk dan warna yang
berbeda-beda tergantung spesies kapang, sedangkan identifikasi secara mikroskopis dilakukan dengan cara mengamati struktur kapang di
bawah mikroskop setelah sebelumnya ditumbuhkan terlebih dahulu pada kultur slide selama 3 hari.
Identifikasi spesies kapang ditentukan dengan membandingkan ciri-ciri makroskopis dan mikroskopis kapang tersebut dengan ciri-ciri
kapang yang terdapat pada pustaka. Berdasarkan kunci identifikasi Pitt dan Hocking 1997, penggolongan Ordo Mucorales ke dalam
genus berdasarkan pada morfologi sporangiofor dan sporangium Lampiran 3. Penggolongan Rhizopus dan Mucor ke dalam spesies
berdasarkan kunci identifikasi Gilman 1957 di mana penggolongan Mucor ke dalam spesies berdasarkan ukuran sporangium dan
sporangiospora, warna hifa serta suhu optimum pertumbuhan Lampiran 4, sedangkan penggolongan Rhizopus ke dalam spesies
berdasarkan perkembangan rhizoid, ukuran spora dan sporangiofor Lampiran 5. Deskripsi Chlamydomucor oryzae berdasarkan Heyne
1987 dan penggolongan Aspergillus ke dalam spesies berdasarkan warnapigmentasi konidia Raper dan Fennell 1973 Lampiran 6.
Konfirmasi beberapa spesies kapang dilakukan di Laboratorium Fitopatologi, SEAMEO BIOTROP Bogor.
3. Identifikasi Khamir
Identifikasi khamir yang dilakukan dalam penelitian ini hanya meliputi pengamatan terhadap morfologi serta uji-uji sifat fisiologis
khamir yang meliputi uji fermentasi dan asimilasi gula-gula, kemampuan
tumbuh pada suhu 37
o
C serta kemampuan untuk membentuk pati ekstraseluler Lampiran 7. Hasil pengamatan morfologi dan uji fisiologis
selanjutnya dicocokkan dengan ciri-ciri khamir pada pustaka Lodder 1974 dan Barnett et al. 2000.
a. Karakteristik Morfologi Khamir Lodder 1974
Isolat khamir digoreskan pada permukaan media CMA kemudian ditutup dengan cover glass dan diinkubasi pada suhu 28-30
o
C selama 3 hari. Bagian sisi atau tepi koloni yang tumbuh diamati di bawah
mikroskop dengan perbesaran 400x untuk melihat ada tidaknya miselium semu atau sejati, blastospora dan arthrospora.
b. Uji Fermentasi Gula Lodder 1974
Mula-mula dilakukan penyegaran isolat khamir pada tabung agar miring PDA dan diinkubasi selama 2 hari pada suhu 28-30
o
C. Selanjutnya secara aseptis dibuat suspensi khamir dengan
menambahkan 5 ml akuades steril ke dalam tabung yang berisi isolat khamir. Media fermentasi gula di dalam tabung reaksi diinokulasi
dengan menambahkan 0,1 ml suspensi khamir Lampiran 2. Setelah dikocok, media diinkubasi pada suhu 28-30
o
C dan dilakukan pengamatan terhadap pembentukan gas pada tabung Durham dan
pembentukan asam setiap hari ke -3, 7 dan 14.
c. Uji Asimilasi Karbon Lodder 1974
Sebanyak 1 ml suspensi khamir diinokulasikan ke dalam cawan Petri, kemudian dita mbahkan media YNB + agar noble sebanyak 15-
20ml. Setelah membeku, sebanyak 5 mg gula-gula yang akan diuji ditaburkan secara terpisah. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 28-30
o
C dan diamati pada hari ke-3 dan 7 untuk mengetahui ada tidaknya
pertumbuhan yang menunjukkan sumber karbon tersebut dapat diasimilasi atau tidak oleh khamir yang diuji.
d. Uji Pertumbuhan pada Suhu 37
o
C Lodder 1974
Isolat khamir digoreskan pada tabung agar miring PDA dan diinkubasi pada suhu 37
o
C untuk menentukan kemampuan tumbuh khamir pada suhu tersebut.
e. Uji Kemampuan Membentuk Pati Ekstraseluler Lodder 1974
Isolat khamir digoreskan pada cawan Petri yang berisi media PDA dan diinkubasi pada suhu 28-30
o
C selama 3 hari, selanjutnya pada koloni khamir yang terbentuk ditete si larutan iod untuk mengetahui
kemampuan membentuk pati. Apabila terbentuk warna biru, berarti khamir tersebut membentuk pati.
4. Persiapan Spora Kapang dan Sel Khamir Kim et al. 2000
Kultur murni kapang dan khamir disegarkan dengan cara menggoreskan kembali kultur murni tersebut pada agar miring PDA yang
baru, kemudian kapang diinkubasi pada suhu 28-30
o
C selama 7 hari, sedangkan khamir 2 hari.
Suspensi spora dibuat dengan menambahkan akuades steril yang mengandung Tween 80 0,1 ke dalam tabung agar miring, sedangkan
suspensi khamir tanpa penambahan Tween 80. Suspensi spora kapang dan sel khamir dihitung menggunakan hemasitometer kemudian diatur
konsentrasinya menjadi 10
6
spora kapangml atau 10
6
sel khamirml dan digunakan untuk uji selanjutnya.
5. Uji Kemampuan Isolat Kapang dan Khamir dalam Mereduksi
Kandungan Aflatoksin Modifikasi Sardjono et al. 1992
Sebanyak 0,5 ml suspensi spora A. parasiticus dengn konsentrasi 10
6
sporaml dicampur dengan 0,5 ml 10
6
sporaml atau 10
6
selml suspens i spora isolat kapang atau sel khamir yang diuji, diinokulasikan ke
dalam 100 ml medium PDB dan diinkubasi selama 10 hari pada suhu 28-30
o
C. Sebagai kontrol, sebanyak 0,5 ml suspensi spora A. parasiticus 10
6
sporaml diinokulasi pada medium PDB, kemudian diinkubasi pada waktu dan kondisi yang sama. Setelah itu dilakukan analisis aflatoksin dan
dihitung reduksi aflatoksin dari isolat kapang atau khamir uji dibandingkan dengan kandungan aflatoksin pada kontrol.
Persentase reduksi aflatoks in ditentukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
A – B reduksi aflatoksin = x 100
A Keterangan :
A : Kandungan aflatoksin yang dihasilkan oleh A. parasiticus kontrol
B : Kandungan aflatoksin yang dihasilkan oleh A. parasiticus yang
ditumbuhkan bersama-sama dengan isolat kapangkhamir
6. Uji Kemampuan Penghambatan Kapang dan Khamir terhadap