Isolasi Kapang dan Khamir Daulay 1989 Persiapan Spora Kapang dan Sel Khamir Kim et al. 2000 Uji Kemampuan Isolat Kapang dan Khamir dalam Mereduksi

1. Isolasi Kapang dan Khamir Daulay 1989

Sebanyak 5 g ragi tape berbentuk bubuk ditambah dengan 45 ml akuades steril, setelah itu dilakukan pengenceran 10 -2, 10 -3 , 10 -4 dan seterusnya. Selanjutnya dilakukan pemupukan cawan sebanyak 1 ml suspensi ragi tape, kemudian 15 ml medium APDA PDA+asam tartarat 10 dituang ke dalam cawan dan diratakan, setelah itu diinkubasi selama 2-3 hari pada suhu 28-30 o C. Setiap koloni kapang dan khamir yang berbeda warna dan penampilannya dipisahkan dan dimurnikan, selanjutnya digores kembali pada PDA miring dan disimpan di kulkas sebagai kultur stok.

2. Identifikasi Kapang dari Ragi Tape

a. Pembuatan Kultur Slide Harrigan 1998

Untuk membuat kultur slide dibutuhkan cawan petri yang di dalamnya terdapat gelas obyek yang diletakkan di atas batang U atau V, perangkat tersebut berada dalam keadaan steril. Potongan medium PDA steril berukuran 1x1 cm diletakkan di atas gelas obyek yang berada di dalam cawan petri, selanjutnya dilakukan inokulasi kapang pada potongan agar tepat di tengah-tengah keempat sisinya menggunakan jarum ose. Potongan agar yang telah diinokulasi kemudian ditutup dengan cover glass. Akuades steril diteteskan ke dalam cawan petri tanpa membasahi gelas obyek yang ada di dalamnya, selanjutnya kultur slide diinkubasi pada suhu 28-30 o C sekitar 2-4 hari. Bila spora telah muncul, cover glass diangkat dan diletakkan pada gelas obyek lain yang telah diberi cairan pewarna lactophenol cotton blue, kemudian struktur kapang diamati di bawah mikroskop. Gambar 4 Diagram alir tahap penelitian Koleksi sampel ragi tape Jakarta, Bandung, Semarang, Rembang, Yogyakarta, Madiun Isolasi Kapang dan Khamir Persiapan Spora

A. parasiticus

Seleksi Isolat Kapang dan Khamir dengan Aktivitas Reduksi Aflatoksin terbaik Uji Kemampuan Isolat Kapang dan Khamir untuk Mereduksi Kandungan Aflatoksin Uji Kemampuan Penghambatan Kapang Khamir thd Pertumbuhan A. parasiticus 1. Perhitungan koloni CFUml 2. Karakteristik morfologi 3. Interaksi Langsung antara Khamir dgn A. parasiticus Uji Pengaruh Filtrat KapangKhamir terhadap Biosintesis Aflatoksin 1. Pengukuran Berat Kering Miselium 2. Analisis Aflatoksin 3. Pengukuran pH Uji Kemampuan KapangKhamir dalam Mendegradasi Aflatoksin 1. Analisis Aflatoksin 2. Pengukuran pH Identifikasi Kapang dan Khamir Pembuatan Kultur Stok

b. Identifikasi Isolat Kapang

Identifikasi isolat kapang dilakukan baik secara makroskopis maupun mikroskopis. Identifikasi secara makroskopis dilakukan dengan cara melihat langsung koloni yang tumbuh pada media CYA, MEA dan G25N setelah 2 hari inkubasi pada suhu 28-30 o C. Koloni yang tumbuh akan memiliki spora dengan bentuk dan warna yang berbeda-beda tergantung spesies kapang, sedangkan identifikasi secara mikroskopis dilakukan dengan cara mengamati struktur kapang di bawah mikroskop setelah sebelumnya ditumbuhkan terlebih dahulu pada kultur slide selama 3 hari. Identifikasi spesies kapang ditentukan dengan membandingkan ciri-ciri makroskopis dan mikroskopis kapang tersebut dengan ciri-ciri kapang yang terdapat pada pustaka. Berdasarkan kunci identifikasi Pitt dan Hocking 1997, penggolongan Ordo Mucorales ke dalam genus berdasarkan pada morfologi sporangiofor dan sporangium Lampiran 3. Penggolongan Rhizopus dan Mucor ke dalam spesies berdasarkan kunci identifikasi Gilman 1957 di mana penggolongan Mucor ke dalam spesies berdasarkan ukuran sporangium dan sporangiospora, warna hifa serta suhu optimum pertumbuhan Lampiran 4, sedangkan penggolongan Rhizopus ke dalam spesies berdasarkan perkembangan rhizoid, ukuran spora dan sporangiofor Lampiran 5. Deskripsi Chlamydomucor oryzae berdasarkan Heyne 1987 dan penggolongan Aspergillus ke dalam spesies berdasarkan warnapigmentasi konidia Raper dan Fennell 1973 Lampiran 6. Konfirmasi beberapa spesies kapang dilakukan di Laboratorium Fitopatologi, SEAMEO BIOTROP Bogor.

3. Identifikasi Khamir

Identifikasi khamir yang dilakukan dalam penelitian ini hanya meliputi pengamatan terhadap morfologi serta uji-uji sifat fisiologis khamir yang meliputi uji fermentasi dan asimilasi gula-gula, kemampuan tumbuh pada suhu 37 o C serta kemampuan untuk membentuk pati ekstraseluler Lampiran 7. Hasil pengamatan morfologi dan uji fisiologis selanjutnya dicocokkan dengan ciri-ciri khamir pada pustaka Lodder 1974 dan Barnett et al. 2000.

a. Karakteristik Morfologi Khamir Lodder 1974

Isolat khamir digoreskan pada permukaan media CMA kemudian ditutup dengan cover glass dan diinkubasi pada suhu 28-30 o C selama 3 hari. Bagian sisi atau tepi koloni yang tumbuh diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x untuk melihat ada tidaknya miselium semu atau sejati, blastospora dan arthrospora.

b. Uji Fermentasi Gula Lodder 1974

Mula-mula dilakukan penyegaran isolat khamir pada tabung agar miring PDA dan diinkubasi selama 2 hari pada suhu 28-30 o C. Selanjutnya secara aseptis dibuat suspensi khamir dengan menambahkan 5 ml akuades steril ke dalam tabung yang berisi isolat khamir. Media fermentasi gula di dalam tabung reaksi diinokulasi dengan menambahkan 0,1 ml suspensi khamir Lampiran 2. Setelah dikocok, media diinkubasi pada suhu 28-30 o C dan dilakukan pengamatan terhadap pembentukan gas pada tabung Durham dan pembentukan asam setiap hari ke -3, 7 dan 14.

c. Uji Asimilasi Karbon Lodder 1974

Sebanyak 1 ml suspensi khamir diinokulasikan ke dalam cawan Petri, kemudian dita mbahkan media YNB + agar noble sebanyak 15- 20ml. Setelah membeku, sebanyak 5 mg gula-gula yang akan diuji ditaburkan secara terpisah. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 28-30 o C dan diamati pada hari ke-3 dan 7 untuk mengetahui ada tidaknya pertumbuhan yang menunjukkan sumber karbon tersebut dapat diasimilasi atau tidak oleh khamir yang diuji.

d. Uji Pertumbuhan pada Suhu 37

o C Lodder 1974 Isolat khamir digoreskan pada tabung agar miring PDA dan diinkubasi pada suhu 37 o C untuk menentukan kemampuan tumbuh khamir pada suhu tersebut.

e. Uji Kemampuan Membentuk Pati Ekstraseluler Lodder 1974

Isolat khamir digoreskan pada cawan Petri yang berisi media PDA dan diinkubasi pada suhu 28-30 o C selama 3 hari, selanjutnya pada koloni khamir yang terbentuk ditete si larutan iod untuk mengetahui kemampuan membentuk pati. Apabila terbentuk warna biru, berarti khamir tersebut membentuk pati.

4. Persiapan Spora Kapang dan Sel Khamir Kim et al. 2000

Kultur murni kapang dan khamir disegarkan dengan cara menggoreskan kembali kultur murni tersebut pada agar miring PDA yang baru, kemudian kapang diinkubasi pada suhu 28-30 o C selama 7 hari, sedangkan khamir 2 hari. Suspensi spora dibuat dengan menambahkan akuades steril yang mengandung Tween 80 0,1 ke dalam tabung agar miring, sedangkan suspensi khamir tanpa penambahan Tween 80. Suspensi spora kapang dan sel khamir dihitung menggunakan hemasitometer kemudian diatur konsentrasinya menjadi 10 6 spora kapangml atau 10 6 sel khamirml dan digunakan untuk uji selanjutnya.

5. Uji Kemampuan Isolat Kapang dan Khamir dalam Mereduksi

Kandungan Aflatoksin Modifikasi Sardjono et al. 1992 Sebanyak 0,5 ml suspensi spora A. parasiticus dengn konsentrasi 10 6 sporaml dicampur dengan 0,5 ml 10 6 sporaml atau 10 6 selml suspens i spora isolat kapang atau sel khamir yang diuji, diinokulasikan ke dalam 100 ml medium PDB dan diinkubasi selama 10 hari pada suhu 28-30 o C. Sebagai kontrol, sebanyak 0,5 ml suspensi spora A. parasiticus 10 6 sporaml diinokulasi pada medium PDB, kemudian diinkubasi pada waktu dan kondisi yang sama. Setelah itu dilakukan analisis aflatoksin dan dihitung reduksi aflatoksin dari isolat kapang atau khamir uji dibandingkan dengan kandungan aflatoksin pada kontrol. Persentase reduksi aflatoks in ditentukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut : A – B reduksi aflatoksin = x 100 A Keterangan : A : Kandungan aflatoksin yang dihasilkan oleh A. parasiticus kontrol B : Kandungan aflatoksin yang dihasilkan oleh A. parasiticus yang ditumbuhkan bersama-sama dengan isolat kapangkhamir

6. Uji Kemampuan Penghambatan Kapang dan Khamir terhadap