3 . Pembuatan Resistant Starch Tipe IV
Sebanyak 100 gram pati dilarutkan dalam 150 ml akuades, diatur pH sampai 10.5 dengan NaOH 5 sambil diaduk dengan kuat. Selanjutnya
ditambah dengan POCl
3
0.2 dari berat tepung, diinkubasi pada environmental orbital shaker
T = 40
o
C, kecepatan putaran 200 rpm, selama 2 jam. Kemudian diatur pH-nya sampai 5.5 menggunakan HCl dan disaring dengan
penyaring vakum. Endapan pati yang diperoleh dicuci dengan air 150 ml sebanyak 5 kali. Selanjutnya, pati dikeringkan menggunakan oven vakum
50
o
C, 24 jam, digiling dan diayak. 4.
Uji Prebiotik secara in vitro
a. Perhitungan jumlah BAL awal Fardiaz, 1989
BAL dibuka dari ampul dan disegarkan ke dalam 10 ml MRSB, kemudian dimasukkan ke dalam inkubator 37
C selama 48 jam. Setelah 48 jam, BAL tersebut kembali disegarkan dengan mengambil 1 ml dari tabung
MRSB lama ke tabung berisi MRSB baru. MRSB itu kemudian diinkubasi kembali selama 48 jam pada suhu 37
C. Metode ini dilakukan untuk setiap BAL Lactobacillus casei subsp.
Rhamnosus, Lactobacillus plantarum, dan Bifidobacterium bifidum yang digunakan. Untuk Bifidobacterium bifidum penanganannya sedikit berbeda
karena bakteri ini hidup secara anaerobik. Maka, inkubasi dilakukan menggunakan alat Anoxomat.
b. Uji viabilitas BAL
1. Persiapan uji viabilitas BAL
Sebanyak 1 ml BAL dipindahkan ke dalam MRSB. Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
C. Kemudian 1 ml BAL yang berumur 1 hari tersebut dipipet dan dimasukkan ke dalam larutan
pengencer NaCl 0.85 10 ml. Setelah divorteks, didapatkan pengenceran 10
-1
. Selanjutnya dibuat pengenceran sampai 10
-7
dengan cara yang sama. Pemupukan dilakukan pada pengenceran 10
-5
-10
-8
dengan menggunakan media MRSA dalam cawan petri. Cawan petri diinkubasi pada suhu 37
C dalam posisi terbalik. Pemupukan dilakukan duplo setiap pengenceran.
Perhitungan koloni dilakukan setelah 48 jam berdasarkan metode ISO Harrigan, 1998 dan dinyatakan dalam CFUml.
N = ____ ∑ c____
n
1
+ 0.1 n
2
x d N : Jumlah mikroba CFUml
∑c : Jumlah koloni dari semua cawan pada 2 tingkat pengenceran yang terdapat 25-250 koloni
n
1
: Jumlah cawan pada pengenceran pertama 25-250 koloni n
2
: Jumlah cawan pada pengenceran kedua 25-250 koloni d : Pengenceran pertama 25-250 koloni
2. Viabilitas BAL
Disiapkan RS steril, air steril masing-masing 50 mlsampel dan MRSB steril tanpa dekstrosa MRSB racikan masing-masing
50mlsampel. Sebanyak 2.5 ml BAL yang berumur 1 hari dipipet dan dimasukkan ke dalam campuran larutan 50 ml MRSB racikan + 2.5 RS
dan larutan 50 ml air steril + 2.5 RS. Larutan ini kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
C. Setelah inkubasi 24 jam, 1 ml larutan dipipet dan dimasukkan ke
dalam larutan pengencer NaCl 0.85 10 ml dan divortex untuk memperoleh pengenceran 10
-1
. Selanjutnya dibuat pengenceran sampai 10
-7
dengan cara yang sama. Pemupukan dilakukan pada pengenceran 10
- 5
-10
-8
dengan menggunakan media MRSA dalam cawan petri. Cawan petri selanjutnya diinkubasi pada suhu 37
C dalam posisi terbalik. Pemupukan dilakukan duplo setiap pengenceran. Perhitungan koloni dilakukan setelah
48 jam berdasarkan metode ISO Harrigan, 1998 dan dinyatakan dalam CFUml.
C. METODE ANALISIS a.
