a. Jika sperma bergerak cepat dan lurus kedepan gerak maju sangat baik b. Jika geraknya lambat atau sulit maju lurus atau bergerak tidak lurus
gerak lemah
c. Jika tidak bergerak maju d. Jika sperma tidak bergerak
Biasanya empat sampai enam lapangan pandang yang harus diperiksa untuk mendapat 100 spermatozoa secara berurutan yang kemudian diklasifikasi
sehingga menghasilkan persentase setiap kategori motilitas. 3. Kecepatan gerak spermatozoa diukur berdasarkan waktu rata-rata yang diperlukan
dari 25 spermatozoa untuk motil dan bergerak lurus menempuh satu kotak mikrohemositometer 120 mm.
4. Morfologi spermatozoa dapat diamati pada sediaan apus dengan pewarnaan Giemsa yang dilakukan sebagai berikut :
a. Reagensia
1. Phosphate buffer, 0.066 M pH 6,9 dibuat sebagai berikut : 320
ml KH
2
PO
4
, 9.1 gL ditambah 400 ml Na
2
HPO
4
, 11.9 gL, diatur pH dengan NaOH dan ditambahkan dengan aquadest sampai
volume menjadi 1 liter. Setelah volume menjadi 1 liter pH harus diukur lagi.
2. Larutan Pewarnaan Giemsa dibuat sebagai berikut :
Tengku Muhammad Fauzi: Pengaruh Pemberian Timbal Asetat Dan Vitamin C Terhadap Kadar Molondialdehyde Dan kualitas Spermatozoa Di Dalam Sekresi Epididimis Mencit Albino Mus Musculus L Strain BalBC, 2008.
USU e-Repository © 2008
7 mL Giemsa Merck : Cat. No.1222 dilarutkan ke dalam 160 mL Phosphate buffer, dan harus selalu dibuat segar untuk setiap kali
pewarnaan.
b. Prosedur pewarnaan
Apusan suspensi spermatozoa yang telah kering difiksasi dengan metanol selama lebih kurang 5 menit, setelah itu dibuang larutan fiksatif dan dibiarkan
sampai kering pada suhu kamar. Apusan diwarnai dengan larutan Giemsa selama 30 menit, kemudian dibilas dengan phosphate buffer, dan dibiarkan sampai
kering pada suhu kamar. Pemeriksaan morfologi spermatozoa dilakukan dengan membedakan
bentuk spermatozoa normal dan abnormal dari 100 spermatozoa yang diamati. Sehingga diperoleh data bentuk spermatozoa dalam persen. Pengamatan
dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran lensa objektif 40 kali. Menurut Hayati et al 2005, kriteria morfologi spermatozoa normal dan
abnormal pada hewan mencit Mus musculus L adalah sebagai berikut : 1. Normal = Akrosom bentuk kepala seperti kurva dengan membentuk kait
hook pada bagian ujung kepala. Bagian leher sampai ujung ekor lurus dengan jumlah ekor tunggaltidak bercabang.
2. Abnormal = terdapat kelainan bentuk kepala seperti : kepala kerdil, tidak mempunyai kepala, tidak ada hook, dan kepala ”amorphus” tidak jelas
Tengku Muhammad Fauzi: Pengaruh Pemberian Timbal Asetat Dan Vitamin C Terhadap Kadar Molondialdehyde Dan kualitas Spermatozoa Di Dalam Sekresi Epididimis Mencit Albino Mus Musculus L Strain BalBC, 2008.
USU e-Repository © 2008
bentuknya. Sedangkan pada ekor dapat dijumpai kelainan seperti: ekor membengkok atau bercabang.
3.6.2 Penentuan kadar MDA di dalam suspensi sekresi cauda epididimis
Pemeriksaan kadar MDA di dalam supensi sekresi cauda epididimis dilakukan menurut Rao et al dalam Hsieh et al, 2006 yang telah dimodifikasi sebagai berikut :
a. Reagensia
1. 2-Thiobarbituric acid Merck ; Cat. No.1.08180.0025 2. 1,1,3,3-Tetramethoxypropane 99 Sigma ; Cat. No. 108383 500 µM
3. Acetic acid glacial
4. Sodium hydroxide NaOH 5.
Aquadest
b. Persiapan Regensia 1.
TBABuffer Reagent
TBABuffer Reagent terdiri dari : 0,67 g 2-thiobarbituric acid dilarutkan dalam 100 mL aquadest, selanjutnya ditambah 0,5 g sodium hidroxyde dan 100 mL
asam asetat glasial.
2. Standard MDA
Sebanyak 250 µL 1,1,3,3- tetramethoxypropane Malondialdehyde bis 500 µM dilarutkan dalam 750 µL aquadest untuk memperoleh larutan stok MDA 125 µM.
Selanjutnya dari larutan stok MDA 125 µM dilarutkan dalam aquadest dan dibuat 8 seri standar MDA yang dapat dilihat pada tabel.3 dibawah ini :
Tengku Muhammad Fauzi: Pengaruh Pemberian Timbal Asetat Dan Vitamin C Terhadap Kadar Molondialdehyde Dan kualitas Spermatozoa Di Dalam Sekresi Epididimis Mencit Albino Mus Musculus L Strain BalBC, 2008.
USU e-Repository © 2008
Tabel 4. Persiapan standar MDA untuk spektrofotometer
Nomor standard
Konsentrasi MDA µM
Volume MDA standard µL
Volume pelarut µL
8 50 400 600 7 25 200 800
6 10 80 920
5 5 40 960 4 2,5 20
980 3 1,25 10
990 2 0,625 5
995 1 0 0 1000
c. Prosedur Uji
1. Sebanyak 500 μl sampel suspensi sekresi cauda epididimis atau standar
MDA dimasukkan dalam tabung ependorf yang masing-masing telah diberi label
2. Ditambahkan 0,5 mL aquadest pada masing-masing tabung. 3. Kemudian ditambahkan 0,5 ml TBABuffer Reagent
4. Selanjutnya masing-masing tabung diinkubasi di dalam waterbath dengan suhu 95
o
C selama 60 menit 5. Setelah diinkubasi, masing-masing tabung di keluarkan dari waterbath dan
setelah dingin masing-masing tabung disentrifugas dengan kecepatan 7000 rpm selama 10 menit.
Tengku Muhammad Fauzi: Pengaruh Pemberian Timbal Asetat Dan Vitamin C Terhadap Kadar Molondialdehyde Dan kualitas Spermatozoa Di Dalam Sekresi Epididimis Mencit Albino Mus Musculus L Strain BalBC, 2008.
USU e-Repository © 2008
6. Supernatan diambil untuk selanjutnya dianalisis dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 534 nm.
3.7. Analisis Data
