2. Metode Biuret Dilakukan dengan cara: larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH
kemudian ditambahkan larutan CuSO
4
encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa-senyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada
bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu membentuk senyawa kompleks ditandai dengan timbulnya warna ungu violet
atau biru violet Bintang, 2010.
2.9.2 Analisis Kuantitatif
Bentuk uji kuantitatif penentuan kadar yang dapat dilakukan: 1. Metode Titrasi Formol
Prinsip metode ini adalah dengan adanya air dan penambahan Kalium oksalat, protein akan dihidrolisis menjadi asam-asam amino. Selanjutnya
dengan penambahan formaldehid akan menghambat gugus basa asam amino membentuk gugus dimethilol sehingga tidak mengganggu reaksi antara NaOH
dengan gugus asam dari asam amino dan konsentrasi protein dapat ditentukan Estiasih, dkk., 2012.
Indikator yang digunakan adalah PP fenolftalein, akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30
detik. Titrasi formol ini hanya tepat untuk menentukan suatu proses terjadinya pemecahan protein Sudarmadji, dkk., 1989.
Dipipet 10 ml larutan putih telur atau larutan protein kedalam erlenmeyer 125 ml dan tambahkan 20 ml akuades dan 0,4 ml larutan kalium
oksalat jenuh K- oksalat : air = 1: 3 dan tambahkan 1 ml fenoftalein 1.
Universitas Sumatera Utara
Diamkan selama 2 menit. Dititrasilah larutan dengan 0,1 N NaOH sampai mencapai warna seperti warna standar atau sampai warna merah jambu.
Setelah warna tercapai, tambahkan 2 ml larutan formaldehid 40 dan titrasilah kembali dengan larutan NaOH sampai warna seperti warna standar tercapai
lagi. Catat titrasi kedua ini. Titrasi koreksi yaitu titrasi kedua dikurangi titrasi blanko merupakan titrasi formol, untuk perhitungan protein Sudarmadji,
dkk., 1984: Protein =
NNaOH 0,1
�� − �� × 1,83 Untuk protein digunakan faktor 1,83
Keterangan : �� = titrasi sampel
�� = titrasi blanko Menurut Sudarmadji, dkk., 1989, reaksi titrasi formol adalah sebagai berikut:
R CH C R C C
Pada pH netral O
R C C + CH
2
O R C COOH NH
3 +
O HOH
2
H N CH
2
OH Formalin
Dimenthilol O
R C COOH + NaOH R C C + H
2
O HOH
2
C N CH
2
OH HOH
2
C N CH
2
OH H
O
ONa O
NH
3 +
OH NaOH
O
H H
H H
Universitas Sumatera Utara
2. Metode Kjeldhal Metode Kjeldahl merupakan metode yang sederhana untuk penetapan
nitrogen total pada asam amino, protein dan senyawa yang mengandung nitrogen. Cara Kjeldahl digunakan untuk menganalisis kadar protein kasar
dalam bahan makanan secara tidak langsung karena senyawa yang dianalisisnya adalah kadar nitrogennya. Dengan mengalikan hasil analisis
tersebut dengan faktor konversi 6,25 diperoleh nilai protein dalam bahan makanan tersebut. Penentuan kadar protein dengan metode ini mengandung
kelemahan karena adanya senyawa lain yang bukan protein yang mengandung N akan tertentukan sehingga kadar protein yang diperoleh langsung dengan
cara kjeldahl ini sering disebut dengan kadar protein kasarcrude protein Sudarmadji, dkk., 1989.
Berlangsung tiga tahap: a. Tahap Destruksi
Pada tahap ini, sampel dipanaskan dalam asam sulfat pekat sehingga terjadi destruksi menjadi unsur-unsurnya. Elemen karbon C dan hidrogen H
teroksidasi menjadi karbon monoksida CO, karbondioksida CO2, dan air H
2
O. Elemen Nitrogen akan berubah menjadi amonium sulfat. Banyaknya asam sulfat yang digunakan untuk destruksi diperhitungkan terhadap
kandungan protein, karbohidrat dan lemak Bintang, 2010. Untuk mempercepat destruksi maka ditambahkan katalisator. Dengan
penambahan katalisator, maka titik didih asam sulfat akan dipertinggi sehingga proses destruksi akan berjalan lebih cepat. Katalisator yang digunakan yaitu
Universitas Sumatera Utara
campuran K
2
SO
4
yang dapat mempercepat proses oksidasi dan juga dapat menaikkan titik didih asam sulfat. Proses destruksi diakhiri jika larutan telah
menjadi warna jernih Bintang, 2010. Reaksi yang terjadi pada proses destruksi Meloan, 1987:
katalisator n – C – NH
2
+ H
2
SO
4
CO2 + NH
4
2SO
4
+ SO
2
pemanasan protein
b. Tahap Destilasi Pada tahap destilasi, amonium sulfat dapat dipecah menjadi amonia,
yaitu dengan penambahan larutan NaOH sampai alkalis dan dipanaskan. Amonia yg dibebaskan ditangkap oleh larutan asam. Asam yg dapat dipakai
adalah H
2
SO
4
. Agar kontak antara larutan asam dengan amonia berjalan sempurna, maka ujung selang pengalir destilat harus tercelup kedalam larutan
asam. Destilasi diakhiri jika semua amonia sudah terdestilasi sempurna menggunakan indikator mengsel sebagai indikator penunjuk. Reaksi yang
terjadi pada tahap destilasi yaitu Bintang, 2010: NH
4 2
SO
4
+ 2 NaOH 2 NH
3
↑ + Na
2
SO
4
+ 2H
2
O
c. Tahap Titrasi Apabila penampung destilat yang digunakan adalah larutan asam sulfat,
maka sisa asam sulfat yang tidak bereaksi dengan amonia dititrasi dengan NaOH 0,025 N menggunakan indikator mengsel indikator campuran metil red
Universitas Sumatera Utara
dan metil blue. Selisih jumlah titrrasi sampel dan blanko merupakan jumlah nitrogen.
N =
������������−������ ������������� 1000
x N NaOH x 14,007 x 100 Setelah diperoleh N selanjutnya dihitung kadar proteinnya dengan
mengalikan N dengan suatu faktor konversi. Besarnya faktor konversi nitrogen tergantung pada persentase nitrogen yang menyusun protein dalam
bahan pangan yg dianalisa tersebut Sudarmadji, dkk., 1989. Reaksi yang terjadi pada tahap titrasi ini yaitu:
NH
3
+ H
2
SO
4
NH
4 2
SO
4
Kelebihan H
2
SO
4
+ 2 NaOH Na
2
SO
4
+ 2H
2
O Bintang, 2010.
Dasar perhitungan penentuan protein menurut Kjeldahl adalah berdasarkan hasil penelitian yang menyatakan bahwa umumnya protein
mengandung rata-rata 16 N dalam protein murni. Apabila jumlah N dalam bahan telah diketahui, maka jumlah protein dihitung dengan mengalikan
jumlah N dengan 10016 N X 6,25. Sedangkan untuk protein-protein tertentu yang telah diketahui komposisinya dengan tepat, maka faktor konversi yang
lebih tepat yang dipakai Meloan, 1987.
Universitas Sumatera Utara
BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
