Persiapan contoh Analisis histologi daging rajungan metode parafin

3.3.1 Persiapan contoh

Rajungan segar yang diperoleh dari Desa Gebang Mekar, Cirebon dibawa menggunakan coolbox dan diberi es untuk menjaga kesegarannya. Rajungan diangkut ke Bogor dengan perjalanan lebih kurang enam jam. Preparasi sampel diawali dengan pencucian rajungan menggunakan air bersih. Hal ini dilakukan untuk membersihkan kotoran yang melekat pada rajungan. Rajungan yang sudah bersih kemudian diukur morfometriknya menggunakan penggaris dengan ukuran 30 cm. Penentuan panjang rajungan dilakukan dengan mengukur bagian cangkang dari kiri ke kanan rajungan secara dorsal dari ujung duri terpanjang, sedangkan penentuan tinggi dengan cara mengukur bagian ujung cangkang rajungan dari atas ke bawah bagian cangkang yang tertinggi. Rajungan yang telah diukur dibagi menjadi dua bagian, yaitu rajungan segar dan kukus. Pengukusan dilakukan dengan cara memasukkan rajungan ke dalam panci berisi air yang telah dipanaskan mencapai suhu 70 C. Pengukusan dilakukan selama 28 menit, kemudian rajungan didinginkan selama 30 menit Purwaningsih et al. 2005, sebelum dan sesudah pengukusan dilakukan penimbangan untuk mengetahui perubahan berat rajungan. Rajungan segar dan kukus kemudian dipreparasi dengan cara memisahkan daging rajungan dari cangkang dan jeroannya. Daging rajungan dari seluruh bagian tubuh digabungkan dan dihaluskan dengan mortar. Daging rajungan segar dan kukus yang telah dipreparasi dimasukkan ke dalam plastik dan ditutup rapat serta diberi kode masing-masing.

3.3.2 Rendemen

Rendemen dihitung sebagai persentasi bobot bagian tubuh rajungan dari bobot awal. Perumusan matematik rendemen adalah sebagai berikut: Rendemen = Bobot contoh g x 100 Berat Total g 3.3.3Analisis kimia Analisis kimia daging rajungan terdiri atas analisis proksimat, protein larut air PLA, protein larut garam PLG serta asam amino.

3.3.3.1 Analisis proksimat

Analisis proksimat yang dilakukan terhadap rajungan meliputi: kadar air, abu, protein dan lemak. 1 Analisis kadar air AOAC 1995 Prinsip analisis kadar air yaitu menguapkan air yang terdapat dalam bahan dengan oven dengan suhu 100-105 o C dalam jangka waktu tertentu hingga diperoleh berat konstan. Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 102-105 C selama 30 menit. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator kurang lebih 30 menit hingga dingin dan ditimbang hingga beratnya konstan. Cawan dan sampel seberat 1-2 gram ditimbang. Cawan dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 102- 105 C selama 6 jam atau hingga diperoleh berat konstan bahan kering. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator dan dibiarkan hingga dingin kemudian ditimbang. Perhitungan kadar air: kadar air = B - C x 100 B - A Keterangan: A = Berat cawan kosong gram B = Berat cawan dengan sampel gram C = Berat cawan dengan sampel setelah dikeringkan gram 2 Analisis kadar abu AOAC 1995 Prinsip analisis kadar abu yaitu membakar bahan dalam tanur dengan suhu 600 o C sehingga seluruh unsur organik habis terbakar dan berubah menjadi gas dan sisanya yang tidak terbakar adalah abu yang merupakan kumpulan dari mineral-mineral yang terdapat dalam bahan. Cawan abu porselen dikeringkan di dalam oven selama 30 menit dengan suhu 105 C, lalu didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang. Sampel sebanyak 1-2 gram dimasukkan ke dalam cawan abu porselen. Cawan abu porselen dipijarkan dalam tungku pengabuan bersuhu sekitar 105 C sampai tidak berasap sampai abu berwarna putih. Cawan dimasukkan ke dalam tanur pada suhu 600 C selama 2-3 jam. Cawan abu porselen didinginkan dalam desikator selama 30 menit, kemudian ditimbang beratnya. Perhitungan kadar abu: Kadar abu: C - A x 100 B - A Keterangan: A = Berat cawan abu porselen kosong gram B = Berat cawan abu porselen dengan sampel gram C = Berat cawan abu porselen dengan sampel setelah dikeringkan gram 3 Analisis kadar protein AOAC 1995 Prinsip analisis protein yaitu penetapan protein kasar dilakukan berdasarkan penentuan kadar nitrogen yang terdapat dalam bahan, kandungan nitrogen yang diperoleh dikalikan dengan angka konversi menjadi nilai protein. Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi dan titrasi. 1 Tahap destruksi Sampel ditimbang seberat 0,5 gram, kemudian dimasukkan ke dalam tabung Kjeltec. Satu butir Kjeltab dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan ditambahkan 10 ml H 2 SO 4 . Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas bersuhu 410 C dan ditambahkan 10 ml air. Proses destruksi dilakukan sampai larutan menjadi bening. 2 Tahap destilasi Isi labu dituangkan ke dalam labu destilasi, lalu ditambahkan dengan akuades 50 ml. Air bilasan juga dimasukkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan larutan NaOH 40 sebanyak 20 ml. Cairan dalam ujung tabung kondensor ditampung dalam erlenmeyer 125 ml berisi larutan H 3 BO 3 dan 3 tetes indikator cairan methyl red dan brom cresol green yang ada di bawah kondensor. Destilasi dilakukan sampai diperolah 200 ml destilat yang bercampur dengan H 3 BO 3 dan indikator dalam erlenmeyer. 3 Tahap titrasi Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan pada Erlenmeyer berubah warna menjadi pink. Perhitungan jumlah nitrogen dalam bahan: Nitrogen = ml HCl sampel – ml HCl blanko x 0,1 N HCl x 14 x 100 mg bahan Kadar protein = Nitrogen x faktor konversi 6,25 4 Analisis kadar lemak AOAC 1995 Prinsip analisis kadar lemak adalah melarutkan lemak yang terdapat dalam suatu bahan dengan pelarut non organik, kemudian pelarut diuapkan sehingga yang terukur hanya kadar lemak dalam bahan saja. Sampel seberat 2 gram W 1 dimasukkan ke dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya W 2 dan disambungkan dengan tabung soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak. Tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi soxhlet, lalu dipanaskan pada suhu 40 C menggunakan pemanas listrik selama 16 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap dan pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 C, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan W 3 . Perhitungan kadar lemak: Kadar lemak = W 3 – W 2 x 100 W 1 Keterangan: W 1 = Berat sampel gram W 2 = Berat labu lemak tanpa lemak gram W 3 = Berat labu lemak dengan lemak gram

3.3.3.2 Analisis protein larut air dan garam Wahyuni 1992 1 Analisis protein larut air

Sampel sebanyak 5 gram ditambahkan 50 ml air, kemudian dihomogenkan dengan waring blender selama 2-3 menit, suhu dijaga agar tetap rendah 5-8 C. Sampel disentrifugasi pada 3400 x G selama 30 menit dengan suhu 10 C, selanjutnya disaring menggunakan kertas saring Whatman no.1. Filtrat ditampung dalam erlenmeyer dan disimpan pada suhu 4 C. Sebanyak 1 ml filtrat dianalisis kandungan proteinnya dengan metode mikro Kjeldahl. Perhitungan kadar protein larut air PLA: Kadar PLA = A - B x Normalitas HCl x 14,007 x fp x 6,25 x 100 mg bahan Keterangan: A = Volume titrasi HCl sampel ml B = Volume titrasi HCl blanko ml fp = faktor pengenceran 2 Analisis protein larut garam Sampel sebanyak 5 gram ditambahkan 50 ml larutan NaCl 5 kemudian dihomogenkan dengan waring blender selama 2-3 menit, suhu dijaga agar tetap rendah 5-8 C. sampel disentrifugasi pada 3400 x G selama 30 menit dengan suhu 10 C kemudian disaring menggunakan kertas saring Whatman no.1. Filtrat ditampung dalam erlenmeyer dan disimpan pada suhu 4 C. sebanyak 1 ml filtrat dianalisis kandungan proteinnya dengan metode mikro Kjeldahl. Perhitungan kadar protein larut garam PLG: Kadar PLG = A - B x Normalitas HCl x 14,007 x fp x 6,25 x 100 mg bahan Keterangan: A = Volume titrasi HCl sampel ml B = Volume titrasi HCl blanko ml Fp = faktor pengenceran

3.3.3.4 Analisis asam amino AOAC 1999 dengan modifikasi

Komposisi asam amino ditentukan dengan HPLC. Sebelum digunakan, perangkat HPLC dan syringe harus dibilas dulu dengan eluen yang akan digunakan selama 2-3 jam dan akuades. Analisis asam amino dengan menggunakan HPLC terdiri atas 4 tahap, yaitu: 1 tahap pembuatan hidrolisat protein; 2 tahap pengeringan; 3 tahap derivatisasi; 4 tahap injeksi serta analisis asam amino. 1 Tahap pembuatan hidrolisat protein Sampel sebanyak 30 mg ditimbang dan dihancurkan. Sampel yang telah hancur dihidrolisis asam menggunakan HCl 6 N sebanyak 1 ml yang kemudian dipanaskan dalam oven pada suhu 110 C selama 24 jam. Pemanasan dalam oven dilakukan untuk menghilangkan gas atau udara yang ada pada sampel dan mempercepat reaksi hidrolisis. 2 Tahap pengeringan Sampel yang telah dihidrolisis pada suhu kamar dipindahkan isinya ke dalam labu evaporator 50 ml, dibilas dengan 2 ml HCl 0,01 N dan cairan bilasan dimasukkan ke dalam labu evaporator. Proses ini diulangi hingga 2-3 kali. Sampel kemudian dikeringkan menggunakan freeze dryer dalam keadaan vakum untuk mengubah sistein menjadi sistin, ditambahkan 10-20 ml air ke dalam sampel dan dikeringkan dengan freeze dryer. Proses ini diulangi hingga 2-3 kali. 3 Tahap derivatisasi Larutan derivatisasi sebanyak 30 µl ditambahkan pada hasil pengeringan, larutan derivatisasi dibuat dari campuran larutan stok OPA dengan larutan buffer kalium borat pH 10,4 dengan perbandingan 1:2. Larutan stok OPA dibuat dengan cara mencampurkan 50 mg OPA ke dalam 4 ml metanol dan 0,025 ml merkaptoetanol, dikocok hati-hati dan ditambahkan larutan brij-30 30 sebanyak 0,050 ml dan buffer borat 1 M, pH 10,4 sebanyak 1 ml. Larutan stok pereaksi OPA disimpan pada botol berwarna gelap pada suhu 4 o C. Proses derivatisasi dilakukan agar detektor mudah untuk mendeteksi senyawa yang ada pada sampel. Selanjutnya dilakukan pengenceran dengan cara menambahkan 20 ml asetonitril 60 atau buffer natrium asetat 1 M, lalu dibiarkan selama 20 menit. Kemudian disaring menggunakan kertas saring Whatman. 4 Injeksi ke HPLC Hasil saringan diambil sebanyak 5 µl untuk diinjeksikan ke dalam HPLC. Konsentrasi asam amino yang ada pada bahan ditentukan dengan pembuatan kromatogram standar dengan menggunakan asam amino yang telah siap pakai yang mengalami perlakuan yang sama dengan sampel. Kandungan asam amino dalam 100 gram bahan dapat dihitung dengan rumus: asam amino = Luas daerah sampel x C x fp x BM x 100 Luas daerah standar Bobot sampel µg Keterangan: C = Konsentrasi standar asam amino µgml fp = faktor pengenceran BM = Bobot molekul dari masing-masing asam amino gml Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis asam amino sebagai berikut: Temperatur : 27 C suhu ruang Jenis kolom HPLC : Ultra techspere Coloum C-18 Kecepatan alir eluen : 1 mlmenit Tekanan : 3000 psi Fase gerak : Buffer Na-Asetat dan methanol 95 Detektor : Fluoresensi Panjang gelombang : 254 nm

3.3.4 Analisis histologi daging rajungan metode parafin

Analisis histologi daging rajungan segar dan kukus jenis daging jumbo diawali dengan pembuatan preparat daging rajungan Portunus pelagicus. Pembuatan preparat sendiri dimulai dengan fiksasi selama 24-48 jam dalam larutan bouin’s. Fiksasi dilakukan untuk mencegah kerusakan dan mempertahankan keadaan jaringan seperti keadaan hidup. Larutan fiksatif dibuang, sampel direndam dalam alkohol 70 selama 24 jam. Proses dehidrasi dilakukan dengan perendaman jaringan rajungan sebanyak lima kali dalam larutan alkohol dengan konsentrasi masing-masing 80, 90, 95, 95 dan 100 selama masing-masing 2 jam kecuali untuk konsentrasi 100 selama satu malam. Proses clearing dilakukan dengan cara bahan dipindahkan ke dalam wadah berisi larutan alkohol 100 baru selama satu jam. Bahan dipindahkan ke dalam larutan alkohol-xylol 1:1, xylol I, xylol II, xylol III selama masing-masing setengah jam. Bahan kemudian dipindahkan ke dalam larutan xylol-parafin 1:1 selama 45 menit dan dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 65-70 o C. Pergantian parafin dilakukan setiap 45 menit sekali sebanyak 3 kali pergantian. Proses blocking dilakukan dengan memindahkan larutan parafin ke dalam cetakan dan dilakukan penyusunan jaringan di dalam cetakan. Cetakan parafin disimpan pada suhu ruang selama satu malam. Setelah proses blocking selesai, dilakukan penyayatan dengan mikrotom Yamoto RV-240 putar setebal 7-8 µm. Hasil sayatan kemudian direkatkan pada gelas obyek, selanjutnya direndam dalam larutan xylol I, xylol II, alkohol 100 I, alkohol 100 II, alkohol 95, alkohol 90, alkohol 80, alkohol 70 dan alkohol 50 masing-masing selama tiga menit. Gelas objek dicuci menggunakan air bersih yang mengalir. Preparat diwarnai dengan haematoxylin selama tujuh menit dan eosin selama satu menit. Pada proses pewarnaan, gelas obyek direndam ke dalam larutan alkohol 50, alkohol 70, alkohol 85, alkohol 90, alkohol 100 I, alkohol 100 II selama masing-masing dua menit, dilanjutkan perendaman dalam larutan xylol I dan xylol II selama masing-masing 2 menit. Preparat direkatkan menggunakan entellan atau Canada balsam dengan gelas penutup, kemudian diberi label di sebelah kiri gelas obyek. Preparat diamati menggunakan mikroskop cahaya merk Olympus CH30 dan difoto menggunakan kamera digital merk canon. 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Karakteristik Rajungan Portunus pelagicus

Rajungan yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari Desa Gebang Mekar, Kecamatan Gebang, Kabupaten Cirebon, Jawa Barat. Rajungan memiliki ciri-ciri capitnya kokoh, panjang dan berduri-duri dan mempunyai karapas berbentuk bulat pipih. Warna dasar rajungan ini adalah kebiru-biruan atau kehijau-hijauan bercak-bercak putih. Gambar rajungan Portunus pelagicus secara dorsal dan ventral dapat dilihat pada Gambar 6. a b Gambar 6 Rajungan dorsal a dan ventral b. Pengukuran yang dilakukan terhadap rajungan meliputi pengukuran panjang, lebar dan bobot. Karakteristik ukuran dan bobot rajungan dapat dilihat pada Tabel 5. Rajungan yang digunakan dalam penelitian disajikan pada Lampiran 2. Tabel 5 Ukuran panjang dan bobot rajungan Parameter Satuan Nilai Panjang cm 11,20 ± 0,89 Lebar cm 5,17 ± 0,49 Bobot total g 95,10 ± 9,53 Keterangan : Sampel 30 ekor rajungan Tabel 5 menunjukkan bahwa rajungan yang ditangkap oleh nelayan di Desa Gebang Mekar, Cirebon memiliki panjang rata-rata 11,20 cm, lebar rata-rata 5,17 cm dan bobot rata-rata 95,1 gram. Rajungan bisa mencapai panjang maksimum 18 cm. Perbedaan antara rajungan jantan dan betina terlihat sangat mencolok walaupun belum memasuki tahap dewasa Suwignyo et al. 1998. Rajungan bisa hidup di dasar perairan sampai kedalaman 35 meter dan hidup