Analisis asam amino AOAC 1999 dengan modifikasi

dilakukan untuk menghilangkan gas atau udara yang ada pada sampel dan mempercepat reaksi hidrolisis. 2 Tahap pengeringan Sampel yang telah dihidrolisis pada suhu kamar dipindahkan isinya ke dalam labu evaporator 50 ml, dibilas dengan 2 ml HCl 0,01 N dan cairan bilasan dimasukkan ke dalam labu evaporator. Proses ini diulangi hingga 2-3 kali. Sampel kemudian dikeringkan menggunakan freeze dryer dalam keadaan vakum untuk mengubah sistein menjadi sistin, ditambahkan 10-20 ml air ke dalam sampel dan dikeringkan dengan freeze dryer. Proses ini diulangi hingga 2-3 kali. 3 Tahap derivatisasi Larutan derivatisasi sebanyak 30 µl ditambahkan pada hasil pengeringan, larutan derivatisasi dibuat dari campuran larutan stok OPA dengan larutan buffer kalium borat pH 10,4 dengan perbandingan 1:2. Larutan stok OPA dibuat dengan cara mencampurkan 50 mg OPA ke dalam 4 ml metanol dan 0,025 ml merkaptoetanol, dikocok hati-hati dan ditambahkan larutan brij-30 30 sebanyak 0,050 ml dan buffer borat 1 M, pH 10,4 sebanyak 1 ml. Larutan stok pereaksi OPA disimpan pada botol berwarna gelap pada suhu 4 o C. Proses derivatisasi dilakukan agar detektor mudah untuk mendeteksi senyawa yang ada pada sampel. Selanjutnya dilakukan pengenceran dengan cara menambahkan 20 ml asetonitril 60 atau buffer natrium asetat 1 M, lalu dibiarkan selama 20 menit. Kemudian disaring menggunakan kertas saring Whatman. 4 Injeksi ke HPLC Hasil saringan diambil sebanyak 5 µl untuk diinjeksikan ke dalam HPLC. Konsentrasi asam amino yang ada pada bahan ditentukan dengan pembuatan kromatogram standar dengan menggunakan asam amino yang telah siap pakai yang mengalami perlakuan yang sama dengan sampel. Kandungan asam amino dalam 100 gram bahan dapat dihitung dengan rumus: asam amino = Luas daerah sampel x C x fp x BM x 100 Luas daerah standar Bobot sampel µg Keterangan: C = Konsentrasi standar asam amino µgml fp = faktor pengenceran BM = Bobot molekul dari masing-masing asam amino gml Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis asam amino sebagai berikut: Temperatur : 27 C suhu ruang Jenis kolom HPLC : Ultra techspere Coloum C-18 Kecepatan alir eluen : 1 mlmenit Tekanan : 3000 psi Fase gerak : Buffer Na-Asetat dan methanol 95 Detektor : Fluoresensi Panjang gelombang : 254 nm

3.3.4 Analisis histologi daging rajungan metode parafin

Analisis histologi daging rajungan segar dan kukus jenis daging jumbo diawali dengan pembuatan preparat daging rajungan Portunus pelagicus. Pembuatan preparat sendiri dimulai dengan fiksasi selama 24-48 jam dalam larutan bouin’s. Fiksasi dilakukan untuk mencegah kerusakan dan mempertahankan keadaan jaringan seperti keadaan hidup. Larutan fiksatif dibuang, sampel direndam dalam alkohol 70 selama 24 jam. Proses dehidrasi dilakukan dengan perendaman jaringan rajungan sebanyak lima kali dalam larutan alkohol dengan konsentrasi masing-masing 80, 90, 95, 95 dan 100 selama masing-masing 2 jam kecuali untuk konsentrasi 100 selama satu malam. Proses clearing dilakukan dengan cara bahan dipindahkan ke dalam wadah berisi larutan alkohol 100 baru selama satu jam. Bahan dipindahkan ke dalam larutan alkohol-xylol 1:1, xylol I, xylol II, xylol III selama masing-masing setengah jam. Bahan kemudian dipindahkan ke dalam larutan xylol-parafin 1:1 selama 45 menit dan dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 65-70 o C. Pergantian parafin dilakukan setiap 45 menit sekali sebanyak 3 kali pergantian. Proses blocking dilakukan dengan memindahkan larutan parafin ke dalam cetakan dan dilakukan penyusunan jaringan di dalam cetakan. Cetakan parafin disimpan pada suhu ruang selama satu malam. Setelah proses blocking selesai, dilakukan penyayatan dengan mikrotom Yamoto RV-240 putar setebal 7-8 µm. Hasil sayatan kemudian direkatkan pada gelas obyek, selanjutnya direndam dalam larutan xylol I, xylol II, alkohol 100 I, alkohol 100 II, alkohol 95, alkohol 90, alkohol 80, alkohol 70 dan alkohol 50 masing-masing selama tiga menit. Gelas objek dicuci menggunakan air bersih yang mengalir. Preparat diwarnai dengan haematoxylin selama tujuh menit dan eosin selama satu menit. Pada proses pewarnaan, gelas obyek direndam ke dalam larutan alkohol 50, alkohol 70, alkohol 85, alkohol 90, alkohol 100 I, alkohol 100 II selama masing-masing dua menit, dilanjutkan perendaman dalam larutan xylol I dan xylol II selama masing-masing 2 menit. Preparat direkatkan menggunakan entellan atau Canada balsam dengan gelas penutup, kemudian diberi label di sebelah kiri gelas obyek. Preparat diamati menggunakan mikroskop cahaya merk Olympus CH30 dan difoto menggunakan kamera digital merk canon.