Perhitungan kadar protein larut air PLA: Kadar PLA = A - B x Normalitas HCl x 14,007 x fp x 6,25 x 100
mg bahan
Keterangan: A = Volume titrasi HCl sampel ml B = Volume titrasi HCl blanko ml
fp = faktor pengenceran
2 Analisis protein larut garam
Sampel sebanyak 5 gram ditambahkan 50 ml larutan NaCl 5 kemudian dihomogenkan dengan waring blender selama 2-3 menit, suhu dijaga agar tetap
rendah 5-8 C. sampel disentrifugasi pada 3400 x G selama 30 menit dengan
suhu 10 C kemudian disaring menggunakan kertas saring Whatman no.1. Filtrat
ditampung dalam erlenmeyer dan disimpan pada suhu 4 C. sebanyak 1 ml filtrat
dianalisis kandungan proteinnya dengan metode mikro Kjeldahl. Perhitungan kadar protein larut garam PLG:
Kadar PLG = A - B x Normalitas HCl x 14,007 x fp x 6,25 x 100 mg bahan
Keterangan: A = Volume titrasi HCl sampel ml B = Volume titrasi HCl blanko ml
Fp = faktor pengenceran
3.3.3.4 Analisis asam amino AOAC 1999 dengan modifikasi
Komposisi asam amino ditentukan dengan HPLC. Sebelum digunakan, perangkat HPLC dan syringe harus dibilas dulu dengan eluen yang akan
digunakan selama 2-3 jam dan akuades. Analisis asam amino dengan menggunakan HPLC terdiri atas 4 tahap, yaitu: 1 tahap pembuatan hidrolisat
protein; 2 tahap pengeringan; 3 tahap derivatisasi; 4 tahap injeksi serta analisis asam amino.
1 Tahap pembuatan hidrolisat protein
Sampel sebanyak 30 mg ditimbang dan dihancurkan. Sampel yang telah hancur dihidrolisis asam menggunakan HCl 6 N sebanyak 1 ml yang kemudian
dipanaskan dalam oven pada suhu 110 C selama 24 jam. Pemanasan dalam oven
dilakukan untuk menghilangkan gas atau udara yang ada pada sampel dan mempercepat reaksi hidrolisis.
2 Tahap pengeringan
Sampel yang telah dihidrolisis pada suhu kamar dipindahkan isinya ke dalam labu evaporator 50 ml, dibilas dengan 2 ml HCl 0,01 N dan cairan bilasan
dimasukkan ke dalam labu evaporator. Proses ini diulangi hingga 2-3 kali. Sampel kemudian dikeringkan menggunakan freeze dryer dalam keadaan vakum untuk
mengubah sistein menjadi sistin, ditambahkan 10-20 ml air ke dalam sampel dan dikeringkan dengan freeze dryer. Proses ini diulangi hingga 2-3 kali.
3 Tahap derivatisasi
Larutan derivatisasi sebanyak 30 µl ditambahkan pada hasil pengeringan, larutan derivatisasi dibuat dari campuran larutan stok OPA dengan larutan buffer
kalium borat pH 10,4 dengan perbandingan 1:2. Larutan stok OPA dibuat dengan cara mencampurkan 50 mg OPA ke dalam 4 ml metanol dan 0,025 ml
merkaptoetanol, dikocok hati-hati dan ditambahkan larutan brij-30 30 sebanyak 0,050 ml dan buffer borat 1 M, pH 10,4 sebanyak 1 ml. Larutan stok pereaksi
OPA disimpan pada botol berwarna gelap pada suhu 4
o
C. Proses derivatisasi dilakukan agar detektor mudah untuk mendeteksi senyawa yang ada pada sampel.
Selanjutnya dilakukan pengenceran dengan cara menambahkan 20 ml asetonitril 60 atau buffer natrium asetat 1 M, lalu dibiarkan selama 20 menit. Kemudian
disaring menggunakan kertas saring Whatman.
4 Injeksi ke HPLC
Hasil saringan diambil sebanyak 5 µl untuk diinjeksikan ke dalam HPLC. Konsentrasi asam amino yang ada pada bahan ditentukan dengan pembuatan
kromatogram standar dengan menggunakan asam amino yang telah siap pakai yang mengalami perlakuan yang sama dengan sampel.
Kandungan asam amino dalam 100 gram bahan dapat dihitung dengan rumus: asam amino = Luas daerah sampel x C x fp x BM x 100
Luas daerah standar Bobot sampel µg Keterangan: C = Konsentrasi standar asam amino µgml
fp = faktor pengenceran BM = Bobot molekul dari masing-masing asam amino gml
