Sedangkan auksokrom adalah gugus fungsional seperti –OH, -NH
2
, -X, yaitu gugus yang mempunyai elektron nonbonding dan tidak
mengabsorbsi radiasi pada diatas 200 nm, akan tetapi mengabsorbsi radiasi UV jauh Harmita, 2006.
Ruang lingkup spektroskopi serapan dapat diperluas dengan menggunakan reaksi warna, yang seringkali diiringi dengan peningkatan
sensitivitas atau selektivitas. Reaksi warna digunakan untuk memodifikasi spektrum dari molekul pengabsorbsi sehingga dapat dideteksi pada daerah
visible, dan terpisah dari senyawa pengganggu lain yang memiki serapan di daerah UV. Selain itu, modifikasi kimia ini dapat digunakan untuk
mengubah molekul yang tidak mengabsorbsi menjadi senyawa turunan yang stabil yang memiliki serapan yang bermakna.
Panjang gelombang dimana absorbsi spektrum maksimum disebut panjang gelombang maksimum maks. Pengukuran ditunjukkan untuk
menghitung jumlah senyawa dalam sampel. Jika konsentrasi senyawa semakin tinggi maka lebih banyak cahaya yang diabsorbsi oleh sampel.
2.6. Validasi Metode
2.6.1. Pengertian Validasi Metode
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk
membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaanya. Harmita, 2006
2.6.2. Parameter Validasi
Metode 1.
Kecermatan Accuracy
Kecermatan adalah kedekatan hasil penetapan yang diperoleh dengan hasil sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai hasil
perolehan kembali dari analit yang ditambahkan. Cara penentuan akurasi dapat dilakukan dengan cara absolute dan cara
audisi. Syarat akurasi yang baik : 98 – 102 , untuk sampel hayati biologis atau nabati : ±10 . Beberapa pendapat mangatakan antara
95-105 , dan beberapa berpendapat antara 80-120 . Hal ini dikarenakan semakin kompleks penyiapan sampel dan semakin sulit
metode analisis yang digunakan, maka recovery yang diperbolehkan semakin rendah atau kisarannya semakin lebar. Perhitungannya sebagai
berikut : Perolehan kembali = Kadar hasil analisis x 100
Kadar sesungguhnya Dianjurkan untuk melakukan penentuan akurasi dengan 5 konsentrasi
berbeda. Gandjar, 2009
2. Keseksamaan precision
Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual
dari rata – rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel – sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Keseksamaan
diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif koefisien variasi. Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai keterulangan
repeatability atau ketertiruan reproducibility. Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif atau
koefisien variasi 2 atau kurang. Keseksamaan dapat dihitung dengan cara sebagai berikut :
a. Hasil analisis adalah x
1
, x
2
, x
3
, x
4
,……………….x
n
maka simpangan bakunya adalah : SD =
√ ∑ x – x
2
n – 1 b.
Simpangan baku relatif atau koefisien variasi KV adalah : KV = SD x 100 Harmita, 2006
x 3. Selektivitas specificity
Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan
adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan
degree of bias metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai,
senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang
ditambahkan. Pada metode analisa yang melibatkan kromatografi, selektivitas ditentukan melalui perhitungan daya resolusinya Rs.
Pemisahan kromatogram yang baik diperoleh bila nilai resolusinya lebih besar dari 1,5 Gandjar, 2009.
4. Linearitas dan Rentang
Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik
yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit
yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima. Penentuan linearitas
dalam praktek, digunakan satu seri larutan yang berbeda konsentrasinya antara 50 – 150 kadar analit dalam sampel. Di dalam pustaka, sering
ditemukan rentang konsentrasi yang digunakan antara 0 – 200. Jumlah sampel yang dianalisis sekurang-kurangnya delapan buah
sampel blanko. Sebagai parameter adanya hubungan linier digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linier Y = a + bx. Untuk
memperoleh nilai a dan b digunakan metode kuadrat terkecil least square:
a = Σyi Σxi
2
– Σxi Σyi
N Σxi
2
– Σyi
2
b = N
Σxi.yi - Σxi Σyi N
Σxi
2
– Σxi
2
Linieritas ditentukan berdasarkan nilai koefisien r r
= N Σxy - Σx Σy
[ N Σx
2
– Σx
2
N Σy
2
Σy
2
]
12
Hubungan linear yang ideal dicapai jika nilai b = 0 dan r = +1 atau -1 bergantung pada arah garis. Sedangkan nilai a menunjukkan kepekaan
analisis terutama instrument yang digunakan. Parameter lain yang harus dihitung adalah simpangan baku residual Sy.
Sy =
√ ∑ y
1
– ŷ
1 2
di mana ŷ
1
= a + bx
N – 2
Sx = Sy
Sx = standar deviasi dari fungsi
b
Vx
= Sx
0 X 100
Vx = koefisien variasi dari fungsi
x Syarat kelinearan garis :
a Koefisien korelasi r
r ≥ 0,9990
b Jumlah kuadrat sisa masing-masing titik temu r
i
mendekati nol 0 r
i 2
sekecil mungkin ≈ 0
r
i
= y
i
– b x i + a c
Koefisien fungsi regresi Vx
≤ 2,0 sediaan farmasi ≤ 5,0 sediaan biologi
d Kepekaan analisis
∆y∆x ∆y∆x = y2 – y1 ≈ y3 – y2 ≈ y4 – y5 ≈ y
n
– y
n-1
X2 – x1 X3 – x2 x4 – x5 x
n
– x
n-1
Harmita, 2006
5. Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi
Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat
dikuantitasi. Batas deteksi merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan apakah analit di atas atau di bawah nilai tertentu. Batas
kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat
memenuhi kriteria cermat dan seksama. Pada analisis instrument batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blangko beberapa kali
lalu dihitung simpangan baku respon blangko dan formula di bawah ini dapat digunakan untuk perhitungan
Q = k x S
b
S1 Keterangan :
Q = LOD batas deteksi atau LOQ batas kuantitasi k = 3 untuk batas deteksi atau 10 untuk batas kuantitasi
S
b
= simpangan baku respon analitik dari blangko S1 = arah garis linear kepekaan arah dari kurva antara respon terhadap
konsentrasi = slope b pada persamaan garis y = a+bx Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis
regresi linier dari kurva kalibrasi. Nilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada persamaan garis linier y = a+bx, sedangkan simpangan
baku blangko sama dengan simpangan baku residual Syx
a. Batas deteksi Q
karena k = 3 atau 10 Simpangan baku Sb = Syx, maka
Q = 3. S
y
x
S
1
b. Batas kuantitasi Q
Q = 10. S
y
x
S
1
Harmita, 2006; Gandjar, 2009
2.7. Teknik Sampling
