UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.5.2 Cara Kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati
suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan
penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu
kolom, dan ukuran sampel Rohman, 2007. Prinsip kerja KCKT adalah sebagai berikut: dengan bantuan pompa fasa
gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan
komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan
fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solut-solut tersebut akan keluar kolom
dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer dapat
digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.
2.5.3 Instrumentasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok yaitu: wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak pompa, alat untuk
memasukkan sampel injektor, kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Jhonson, 1991; Gandjar, 2007
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 4. Diagram Alat dan Komponen KCKT Sumber : Harmita, 2006
1. Wadah Fase Gerak Wadah fase gerak terbuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak. Bahan
yang umum digunakan adalah gelas dan baja anti karat. Daya tampung wadah harus lebih besar dari 500 mL, yang dapat digunakan selama 4 jam
untuk kecepatan alir yang umumnya 1-2 mLmenit. 2. Pompa
Untuk mengerakkanmengalirkan fase gerak eluen melalui kolom diperlukan pompa. Pompa harus mampu menghasilkan tekanan 6000 psi pada
kecepatan alir 0,1 –10 mLmenit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem
penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari
gangguan. Pompa ada 2 jenis yaitu pompa volume konstan dan pompa tekanan konstan. Pompa terbuat dari bahan yang inert terhadap semua pelarut.
Bahan yang umum digunakan adalah gelas baja antikarat dan teflon. 3. Injektor
Injektor berfungsi untuk memasukkan cuplikan sampel ke dalam kolom. Suatu injektor dikatakan ideal bila memenuhi kriteria : mudah digunakan,
reprodusibel, dapat menahan tekanan balik yang tinggi. 4. Kolom
Kolom berfungsi untuk memisahkan masing-masing komponen. Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung
pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam memilih kolom adalah panjang kolom, diameter kolom,
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
pengisi kolom, fase gerak dan tekanan kolom. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
a. Kolom analitik: diameter khas adalah 2-6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis kemasan. Untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-
100 cm. Untuk kemasan mikropartikel berpori, umumnya 10-30 cm. b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan
panjang kolom 25-100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan pada
temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi.
5. Detektor Detektor berfungsi untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan dalam
aliran yang keluar dari kolom dan mengukur jumlahnya. Bagian ini diletakkan sesudah kolom dan dihubungkan dengan pencatat. Detektor-
detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan noise yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi tanggapanrespon untuk
semua tipe senyawa. Jenis detektor yang dapat digunakan antara lain, detektor spektrofotometri ultraviolet-visibel, detektor photodiobe-array PDA,
detektor fluoresensi, detektor indeks kimia dan detektor elektrokimia. 6. IntegratorPengolah Data
Alat pengumpul data seperti komputer, integrator atau rekorder, dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan
oleh detektor lalu memplotkannya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dapat dievaluasi oleh analis. Integrator berfungsi untuk
menghitung luas puncak. Gandjar, 2007; Jhonson, 1991 7. Fase Gerak
Dalam KCKT variasi fase gerak sangat beragam dalam hal kepolaran dan selektivitasnya terhadap komponen dalam sampel. Fase gerak atau eluen
biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi
ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel Johnson Stevenson, 1991. Elusi dapat
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dilakukan dengan cara isokratik komposisi fase gerak tetap sama selama elusi atau dengan cara gradien komposisi fase gerak berubah-ubah selama
elusi. Elusi gradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks sampel dengan kisaran polaritas yang luas. Terdapat dua
pemisahan dalam KCKT yaitu fase normal dan fase terbalik, berdasarkan polaritas fase gerak dan fase diam yang digunakan. Untuk fase normal fase
diam lebih polar daripada fase gerak, kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik fase diam
kurang polar daripada fase gerak, kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Secara umum eluen yang baik harus
mempunyai sifat murni, tidak bereaksi dengan kolom, dapat melarutkan cuplikan, selektif terhadap komponen, viskositasnya rendah, harganya relatif
murah, dan dapat memisahkan zat dengan baik. Gandjar, 2007; Wellings, 2006.
2.5.4 Analisa dalam Kromatografi Cair KinerjaTinggi Harmita, 2006
Kategori