UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.3 METODE EKSTRAKSI Ketut Ristiasa et al., 2000
a. Maserasi
Maserasi merupakan cara penyarian sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari dengan beberapa kali
pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruang kamar. Cairan penyari akan menembus dinding sel atau masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat
aktif, zat aktif tersebut akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel. Larutan yang lebih pekat di
dalam sel didesak keluar sel, masuk ke dalam larutan di luar sel. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar
sel dan di dalam sel. Keuntungan cara penyarian dengan maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan.
b. Perkolasi
Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai sempurna exhaustive extraction yang umumnya dilakukan pada temperatur ruangan.
Prinsip perkolasi adalah serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu bejana silinder yang bagian bawahnya diberi sekat berpori. Cairan penyari dialirkan dari atas ke
bawah melalui serbuk tersebut, kemudian melarutkan zat aktif dari sel-sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh.
c. Soklet
Sokletasi merupakan ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru umumnya dilakukan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah
pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik.
d. Digesti
Digesti adalah maserasi kinetik dengan pengadukan kontinu pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan, yaitu secara umum
dilakukan pada temperatur 40-50 C.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.4 TOKOFEROL VITAMIN E
Rumus kimia : C
29
H
50
O
2
Pemerian : Praktis tidak berbau dan tidak berasa. Bentuk alfa
tokoferol dan alfa tokoferol asetat berupa minyak kental jernih, warna kuning atau kuning kehijauan.
Golongan alfa tokoferol tidak stabil terhadap udara dan cahaya terutama dalam suasana alkalis. Bentuk
ester stabil terhadap udara dan cahaya, tetapi tidak stabil dalam suasana alkalis.
Sinonim : 3, 4-dihydro-2, 5, 7, 8-tetramethyl-2-4,8,12-trimethyl-
terdecyl-2H-1-benzopiran-6-ol; 2,5,7,8 tetramethyl- 2-
4’, 8’, 1β’–trimethyldecyl -6-chromanol; α- tochoferol; 5,7,8-trimethyltocol; vitamin antisterilitas;
Eprolin S; Epsilan; Ephynal; Syntopherol; E-vimin; Evipherol;
Etavil; Phytogermine;
Profecundin; Tocopharm; Viprimol; Viteolin; Esorb; Vascuals;
Covitol; Evion. Kelarutan
: tidak larut dalam air, larut dalam etanol, dapat bercampur dengan eter, dengan aseton, dengan
minyak nabati dan dengan kloroform. Kegunaankhasiat : sebagai antioksidan di dalam minyak sayur dan
lemakminyak, untuk pengobatan defisiensi vitamin E, dan mencegah degenerasi otot. Soesilo, 1995
Vitamin E adalah salah satu fitonutrien penting dalam minyak makan. Vitamin ini secara alami memiliki 8 isomer yang dikelompokkan dalam 4
tokoferol α, , , δ dan 4 tokotrienol α, , , δ homolog. Suplemen vitamin E yang ada di pasaran umumnya tersusun atas tokoferol dan tokotrienol yang diyakini
merupakan atioksidan potensial Winarsi, 2007. Alfa-tokoferol adalah bentuk vitamin E paling aktif, yang digunakan pula sebagai standar pengukuran vitamin
E dalam makanan. Bentuk sintetik vitamin E mempunyai aktivitas biologik 50 daripada alfa-tokoferol yang terdapat di alam Almatsier, 2004.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
O R
1
HO R
2
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
H
3
C H
3
C H
H
1 2
3 4
5 6
7 8
Gambar 3. Struktur kimia tokoferol
R
1
R
2
Compound
CH
3
CH
3
α CH
3
H H
CH
3
H H
δ Tabel 4. Keterangan nama senyawa berdasarkan R
1
dan R
2
sumber : Ruperez et al., 2001
Menurut Almatsier 2004 ada empat jenis tokoferol yang penting dalam makanan yaitu
α, , , δ tokoferol. Karakteristik kimia utamanya adalah bertindak sebagai antioksidan dengan adanya gugus fenol pada cincin 6-kromanol.
Tokoferol terdiri atas struktur cincin 6-kromanol dengan rantai samping jenuh panjang enam belas karbon fitol. Perbedaan antarjenis tokoferol terletak pada
jumlah dan posisi gugus metal struktur cincin. Takaran yang dianjurkan untuk konsumsi vitamin E adalah; anak-anak: 4-7
mghari, wanita dewasa: 15 mghari, pria dewasa : 15 mghari. Tolerable Upper Intake Levels ULs atau angka tertinggi dari nilai zat gizi yang bila dikonsumsi
tiap hari tidak membahayakan kesehatan untuk dewasa 19 tahun menurut food and nutrition Board and Institute of medicine IOM 2000 adalah 1000 mghari,
yang di dapatkan dari suplemen.
2.4.1 Tokoferol sebagai Antioksidan
Vitamin E adalah vitamin larut lemak yang sangat berguna selain sebagai antioksidan. Yang terpenting dan paling diakui, peran dari vitamin E yaitu
melindungi polyunsaturated fatty acids PUFAs seperti asam oleat, asam linoleat, asam linolenat dan asam arakhidonat. Selain itu, vitamin E di dalam
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
tubuh sebagai antioksidan alami yang membuang radikal bebas dan molekul oksigen, yang penting dalam mencegah peroksidasi membran asam lemak tak
jenuh Burke, 2007. Tokoferol, terutama α-tokoferol merupakan antioksidan yang mampu
mempertahankan integritas membran. Senyawa tersebut dilaporkan bekerja sebagai scavenger radikal bebas oksigen, peroksida lipid, dan oksigen singlet
Winarsi, 2007. Menurut Archerio et al. 199β α-tokoferol merupakan bentuk
suplemen vitamin E yang paling banyak. Vitamin E atau α-tokoferol merupakan antioksidan yang larut dalam lemak.
Sebagai antioksidan vitamin E berfungsi sebagai donor ion hidrogen yang mampu merubah radikal peroksil hasil peroksida lipid, menjadi radikal tokoferol yang
kurang reaktif, sehingga tidak mampu merusak rantai asam lemak Winarsi, 2007. Di samping itu menurut Salonen et al. 1997, vitamin E dan vitamin C dan
karoten atau kombinasinya dapat menghambat peroksida lipid secara in vivo. Mekanisme antioksidan tokoferol, termasuk transfer satu atom hidrogen dari
grup 6-hidroksil pada cincin kroman, serta inaktivasi singlet oksigen dan spesies reaktif lainnya. Rantai fitil tokoferol terikat pada membran sel bilayer, sedangkan
cincin kroman yang aktif terletak pada permukaan sel. Struktur yang unik tersebut menyebabkan tokoferol dapat bekerja secara efektif sebagai antioksidan, dan
dapat diregenerasi melalui reaksi dengan antioksidan lain seperti asam askorbat.
2.5 KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI KCKT
Kromatografi cair kinerja tinggi KCKT merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh
kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan secara
kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran Soesilo, 1995.
Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian
impurities dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap nonvolatil. KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan protein- protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat
dan lain-lain. Metode dalam kromatografi cair dibagi atas dua macam :
a. Kromatografi Cair Retensif
Pemisahan dicapai melalui interaksi antara zat terlarut dengan fase diam. Tipe ini mencakup fase normal, fase terbalik dan kromatografi ion.
b. Kromatografi Cair Non-retensi
Pemisahan yang dicapai tergantung pada perbedaan besar molekul zat terlarut dimana terjadi antara zat terlarut dengan pori-pori yang terdapat di
permukaan fase diam.
2.5.1 Keuntungan KCKT
a. Waktu analisa cepat
Waktu yang diperlukan biasanya kurang dari satu jam, seringkali hanya 15- 30 menit, untuk analisa yang mudah diperlukan waktu kurang dari 5 menit.
b. Daya pisahnya baik
c. Peka
Kepekaanya sangat tergantung pada jenis detektor dan eluen yang digunakan
d. Pemilihan kolom dan eluen sangat bervariasi
e. Kolom dapat dipakai kembali
f. Mudah untuk molekul besar dan kecil
g. Mudah untuk memperoleh kembali cuplikan, tidak seperti kebanyakan
detektor pada kromatografi gas, detektor KCKT tidak merusak komponen zat yang dianalisis, sehingga zat yang telah dielusi dapat dikumpulkan
dengan mudah setelah melewati detektor. h.
Dapat menghitung sampel dengan kadar yang sangat rendah, hal ini sangat bergantung kepada detektor yang digunakan, namun detektor KCKT dapat
mendeteksi zat sampai dengan kadar ppt.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.5.2 Cara Kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati
suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan
penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu
kolom, dan ukuran sampel Rohman, 2007. Prinsip kerja KCKT adalah sebagai berikut: dengan bantuan pompa fasa
gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan
komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan
fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solut-solut tersebut akan keluar kolom
dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer dapat
digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.
2.5.3 Instrumentasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok yaitu: wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak pompa, alat untuk
memasukkan sampel injektor, kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Jhonson, 1991; Gandjar, 2007
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 4. Diagram Alat dan Komponen KCKT Sumber : Harmita, 2006
1. Wadah Fase Gerak Wadah fase gerak terbuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak. Bahan
yang umum digunakan adalah gelas dan baja anti karat. Daya tampung wadah harus lebih besar dari 500 mL, yang dapat digunakan selama 4 jam
untuk kecepatan alir yang umumnya 1-2 mLmenit. 2. Pompa
Untuk mengerakkanmengalirkan fase gerak eluen melalui kolom diperlukan pompa. Pompa harus mampu menghasilkan tekanan 6000 psi pada
kecepatan alir 0,1 –10 mLmenit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem
penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari
gangguan. Pompa ada 2 jenis yaitu pompa volume konstan dan pompa tekanan konstan. Pompa terbuat dari bahan yang inert terhadap semua pelarut.
Bahan yang umum digunakan adalah gelas baja antikarat dan teflon. 3. Injektor
Injektor berfungsi untuk memasukkan cuplikan sampel ke dalam kolom. Suatu injektor dikatakan ideal bila memenuhi kriteria : mudah digunakan,
reprodusibel, dapat menahan tekanan balik yang tinggi. 4. Kolom
Kolom berfungsi untuk memisahkan masing-masing komponen. Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung
pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam memilih kolom adalah panjang kolom, diameter kolom,
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
pengisi kolom, fase gerak dan tekanan kolom. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
a. Kolom analitik: diameter khas adalah 2-6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis kemasan. Untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-
100 cm. Untuk kemasan mikropartikel berpori, umumnya 10-30 cm. b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan
panjang kolom 25-100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan pada
temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi.
5. Detektor Detektor berfungsi untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan dalam
aliran yang keluar dari kolom dan mengukur jumlahnya. Bagian ini diletakkan sesudah kolom dan dihubungkan dengan pencatat. Detektor-
detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan noise yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi tanggapanrespon untuk
semua tipe senyawa. Jenis detektor yang dapat digunakan antara lain, detektor spektrofotometri ultraviolet-visibel, detektor photodiobe-array PDA,
detektor fluoresensi, detektor indeks kimia dan detektor elektrokimia. 6. IntegratorPengolah Data
Alat pengumpul data seperti komputer, integrator atau rekorder, dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan
oleh detektor lalu memplotkannya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dapat dievaluasi oleh analis. Integrator berfungsi untuk
menghitung luas puncak. Gandjar, 2007; Jhonson, 1991 7. Fase Gerak
Dalam KCKT variasi fase gerak sangat beragam dalam hal kepolaran dan selektivitasnya terhadap komponen dalam sampel. Fase gerak atau eluen
biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi
ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel Johnson Stevenson, 1991. Elusi dapat
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dilakukan dengan cara isokratik komposisi fase gerak tetap sama selama elusi atau dengan cara gradien komposisi fase gerak berubah-ubah selama
elusi. Elusi gradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks sampel dengan kisaran polaritas yang luas. Terdapat dua
pemisahan dalam KCKT yaitu fase normal dan fase terbalik, berdasarkan polaritas fase gerak dan fase diam yang digunakan. Untuk fase normal fase
diam lebih polar daripada fase gerak, kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik fase diam
kurang polar daripada fase gerak, kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Secara umum eluen yang baik harus
mempunyai sifat murni, tidak bereaksi dengan kolom, dapat melarutkan cuplikan, selektif terhadap komponen, viskositasnya rendah, harganya relatif
murah, dan dapat memisahkan zat dengan baik. Gandjar, 2007; Wellings, 2006.
2.5.4 Analisa dalam Kromatografi Cair KinerjaTinggi Harmita, 2006
Analisa KCKT dapat dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif 2.5.4.1 Analisa Kualitatif
Cara yang terbaik adalah dengan menggunakan metode waktu relatif : Ri
st
= Keterangan : t
Ri
= waktu retensi komponen zat t
Rst
= waktu retensi standar 2.5.4.2 Analisa Kuantitatif
Tahapan analisis kuantitatif adalah sebagai berikut : a. Membuat spektrum serapan komponen-komponen yang ada dalam
sampel, b. Mencari panjang gelombang optimum untuk campuran komponen zat
dalam sampel, c. Mencari fase gerak yang sesuai agar komponen-komponen tersebut
memisah R 1,5
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Dasar perhitungan kuantitatif untuk suatu komponen yang dianalisis adalah dengan mengukur luas atau tinggi puncaknya. Harmita, 2006. Ada
beberapa metode yang dapat digunakan : a. Baku luar dengan kurva kalibrasi dan perbandingan luas puncak
Larutan baku dengan berbagai konsentrasi disuntikkan dan diukur luas puncaknya, buat kurva kalibrasi antara luas puncak terhadap konsentrasi,
kadar sampel diperoleh dengan cara memplot luas puncak terhadap konsentrasi. Kadar sampel diperoleh dengan cara memplot luas puncak
sampel pada kurva kalibrasi baku atau dengan perbandingan langsung. CS =
x Cst Keterangan : Cs : konsentrasi sampel
Cst : konsentrasi standar As : luas puncak sampel
Ast : luas puncak standar Kekurangan metode ini adalah diperlukan baku yang murni serta ketelitian
dalam pengenceran dan penimbangan. b. Baku dalam
Sejumlah baku dalam ditambahkan pada sampel dan standar. Kemudian larutan campuran komponen standar dan baku dalam dengan konsentrai
tertentu disunikkan dan di hitung perbandingan luas puncak ke dua zat tersebut. Buat kurva baku antara perbandingan luas puncak terhadap
konsentrasi komponen standar, kadar sampel diperoleh dengan memplot perbandingan luas puncak komponen sampel dengan baku dalam pada kurva
standar, keuntungan menggunakan cara ini adalah kesalahan volume injeksi dieliminer, kesulitan cara ini adalah diperlukan baku dalam yang tepat.
2.6 IDENTIFIKASI KANDUNGAN MINYAK
2.8.1 Gas Chromatography-Mass Spectrometry Kromatografi gas-spektrometri massa atau sering disebut GC-MS Gas
Chromatography-Mass Spectrometry
adalah teknik
analisis yang
menggabungkan dua metode analisis, yaitu Kromatografi Gas dan Spektrometri Massa. Kromatografi gas adalah metode analisis, dimana sampel terpisahkan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
secara fisik menjadi bentuk molekul-molekul yang lebih kecil hasil berupa kromatogram. Sedangkan spektroskopi massa adalah metode analisis, dimana
sampel yang dianalisis akan diubah menjadi ion-ion gasnya, dan massa dari ion- ion tersebut dapat diukur berdasarkan hasil deteksi berupa spektrum massa
Khopkar, 1990. Spektrometri massa merupakan sebuah detektor umum untuk kromatografi gas, karena setiap senyawa yang dapat melewati kromatografi gas
diubah menjadi ion dalam spektrometri massa. Tujuan dari menggabungkan kedua instrument ini yaitu agar pengoperasian kromatografi gas dan spektrometri massa
dapat lebih baik lagi tanpa menurunkan kinerja keduanya Willard et al.,1988. Pemisahan komponen senyawa dalam GC-MS terjadi di dalam kolom GC
dengan melibatkan dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam adalah zat yang ada didalam kolom sedangkan fase gerak adalah gas pembawa Helium
ataupun Hidrogen dengan kemurnian tinggi. Proses pemisahan dapat terjadi karena terdapat perbedaan kecepatan alir dari tiap molekul didalam kolom.
Selanjutnya hasil pemisahan tersebut masuk ke dalam ruang MS yang berfungsi sebagai detektor Hermanto, 2009. Instrumen GC-MS terbagi menjadi bagian-
bagian penting pada instrument Gas Chromatography dan bagian-bagian penting pada instrument Mass Spectrometry. Bagian-bagian pada instrument pada Gas
Chromatography terdiri dari: - Pengatur aliran gas Gas Flow Controller
- Tempat injeksi sampel Injector - Tempat terjadinya pemisahan Kolom
- Penghubung antara Gas Chromatography dan Mass Spectrometry Interface
Sedangkan bagian-bagian dari Mass Spectrometry terdiri dari: - Tempat masuk sampel Interface
- Sumber Ion Ion source - Pompa vakum Vacuum pump
- Penganalisis massa Mass analyzer - Detektor Electron multiple detector
- Sistem pengolah data Personal computer
24 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1 TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret hingga Juni 2013 di Laboratorium Produk Alam, Bidang Botani dan Mikrobiologi - Pusat Penelitian
Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI yang berada di jalan Raya Jakarta
– Bogor Km 46, Cibinong; dan di laboratorium Instrumen, Balai Besar Industri Agro yang berada di Jl. Ir. H. Juanda No. 11, Bogor 16122; serta di
Laboraturium Forensik Lantai 3 Markas Besar POLRI Kebayoran Baru Jakarta Selatan.
3.2 BAHAN DAN ALAT 3.2.1 Bahan Uji
Bahan uji yang digunakan adalah biji kelor Moringa oleifera Lam yang sudah masak +1,7 kg dengan spesifikasi kulit warna coklat kehitaman dan isi
berwarna putih kotor dengan bau tidak spesifik dan rasa sepah yang berasal dari Jepara, Jawa Tengah. Bahan sebelumnya telah dilakukan determinasi dan
authentication specimen di Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi LIPI, Bogor, Jawa Barat.
3.2.2 Bahan Kimia
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah n-heksan, Na
2
SO
4
anhidrat, standar α-Tokoferol 96 grade HPLC Sigma, etanol pro analis
Merck, Tetrahydrofuran THF pro analis Merck, metanol grade HPLC J.T. Baker.
3.2.3 Alat
Timbangan bahan dan timbangan analitik; grinder; rotary evaporator Eyela N-1000; oven; seperangkat alat kempa hidrolis manual; seperangkat instrument
HPLC Perkin Elmer series 200 yang dilengkapi dengan pompa, kolom LiChosper® C18 25 cm x 5 µm, degasser, detektor spektrofotometer UVVIS,