3.4.3 Medium Pemeliharaan Saccharomyces cerevisiae
Medium yang digunakan untuk pemeliharaan Saccharomyces cerevisiae adalah medium padat GYE Glucose Yeast Extract. Biakan murni yang didapat,
selanjutnya digunakan untuk mengetahui kurva pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae pada medium PCA Plate Count Agar agar diketahui waktu yang tepat
untuk memanen dinding sel Saccharomyces cerevisiae sebelum digunakan sebagai elisitor. Selanjutnya produksi dinding sel Saccharomyces cerevisiae
dilakukan pada medium GYE cair. Komposisi medium GYE dan PCA dapat dilihat pada Lampiran 2, halaman 33 dan Lampiran 3, halaman 34.
3.4.4 Medium Elisitasi
Medium yang digunakan untuk elisitasi adalah medium MS Murashige Skoog dengan penambahan zat pengatur tumbuh 1 mgL 2,4-D dan 1 mgL
kinetin dikombinasikan dengan beberapa konsentrasi elisitor dinding sel Saccharomyces cerevisiae 0,00; 0,25; 0,50; 1,00; 2,00; 4,00.
3.5 Prosedur Penelitian 3.5.1. Penanaman Eksplan
Eksplan dipetik dari pucuk daun teh posisi 1, 2, dan 3 Simanjuntak, 2004, eksplan dicuci dengan air mengalir. Sterilisasi dilakukan dengan merendam
eksplan dalam larutan Na-hipoklorit 3 dan larutan HgCl
2
0,1 masing-masing selama 10 menit sambil dikocok pelan, dibilas dengan akuades steril sebanyak
tiga kali. Eksplan dipindahkan pada cawan petri, dihilangkan tepi daunnya, dan dipotong-potong dengan ukuran 1-1,5 cm, kemudian diinokulasi pada
medium induksi kalus medium MS dengan penambahan 2,4-D 1 mgL dan kinetin 1 mgL. Selanjutnya eksplan diinkubasi selama 4 minggu di dalam ruang
steril. Kalus yang terbentuk disubkultur setiap 4 minggu sekali untuk memperbanyak jumlah kalus, untuk pemeliharaan digunakan alkohol 70 dan
disemprotkan pada sekitar botol kultur Sutini, 2009.
3.5.2 Penentuan Kurva Pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae
Ragi saft instan ditimbang sebanyak 0,1 g dan dilarutkan ke dalam 10 mL akuades steril, dipipet sebanyak 0,1 mL dan dibuat cawan sebar pada media GYE
Universitas Sumatera Utara
padat, diinkubasi selama 2 hari untuk mendapatkan biakan murni. Biakan murni Saccharomyces cerevisiae usia 2 hari pada media GYE padat diambil sebanyak 2
ose kemudian disuspensi dengan 10 mL NaCl 0,8 steril. Suspensi Saccharomyces cerevisiae disetarakan dengan larutan Mc. Farlan, selanjutnya
dibuat pengenceran hingga 10
-6
. Suspensi Saccharomyces cerevisiae diambil sebanyak 0,1 mL dengan menggunakan pipet serologi kemudian dibuat cawan
sebar pada media PCA Plate Count Agar setiap 2 jam sekali, selama 24 jam dengan masing-masing sebanyak 2 ulangan duplo. Jumlah koloni yang terbentuk
dihitung pada akhir pengamatan. Berdasarkan data pengamatan yang didapat, diketahui waktu yang tepat fase stasioner untuk pemanenan dinding sel
Saccharomyces cerevisiae Sitinjak, 2000. Kurva pertumbuhan S. cerevisiae dapat dilihat pada Lampiran 6, halaman 37.
3.5.3 Penyiapan Elisitor
Saccharomyces cerevisiae hasil biakan murni pada media GYE padat diinokulasikan sebanyak 2 ose kedalam 4 mL NaCl steril 0,8,
dispektofotometer untuk diketahui jumlah selnya 2,56 x 10
6
selmL. Inokulum yang telah diketahui jumlah selnya dipipet sebanyak 3 mL dan diinokulasi pada
50 mL media GYE cair. Saccharomyces cerevisiae yang telah memasuki fase stasioner dipanen kemudian diotoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 15 psi selama 15 menit, disentrifugasi sebanyak 3 kali masing-masing dengan kecepatan 12.000
rpm selama 15 menit pada suhu ruang. Setiap kali sentrifugasi supernatant dibuang dan diganti dengan akuades sejumlah supernatant yang dibuang. Setelah
tiga kali disentrifugasi, pellet dikeringkan anginkan dan digerus dengan mortar untuk memperoleh serbuk ekstrak dinding sel Saccharomyces cereviviae. Serbuk
ekstrak dinding sel Saccharomyces cereviviae ditimbang dan dilarutkan dalam akuades steril sehingga diperoleh konsentrasi masing-masing 0; 0,25; 0,50; 1,00;
2,00; dan 4,00 kemudian disterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 15 psi selama 15 menit, selanjutnya ekstrak dinding sel Saccharomyces cerevisiae
dapat digunakan sebagai elisitor Pandiangan, 2011.
Universitas Sumatera Utara
3.5.4 Elisitasi
Kategori