D. Alat Penelitian
1. Alat pembuatan FHEMM
Alat-alat yang digunakan dalam pembuatan FHEMM adalah orbital shacker
Optima®, Electric Sieve Shacker Indotest Multi Lab®, timbangan analitik Mettler Toledo®, oven Memmert®, blender Miyako®, rotary vacuum
evaporator IKAVAC ®, penangas air, ayakan no.50, moisture balance, serta
alat-alat gelas Pyrex® berupa gelas beker, labu erlenmeyer, gelas ukur, labu ukur, batang pengaduk, pipet tetes, corong, labu alas bulat dan cawan porselen.
2. Alat uji penetapan kadar air
Moisture balance, beaker glass, sendok.
3. Alat perlakuan hewan uji
Alat-alat yang digunakan dalam perlakuan hewan uji adalah timbangan analitik Mettler Toledo®, spuit injeksi p.o dan syringe 3 cc
Terumo®, spuit injeksi i.p dan syringe 1 cc Terumo®, pipa kapiler, serta alat- alat gelas Pyrex® berupa gelas beker, gelas ukur, labu ukur, batang pengaduk,
pipet tetes, corong, dan pipet ukur.
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman Macaranga tanarius L. Müll. Arg.
Determinasi tanaman Macaranga tanarius L. Müll. Arg. dilakukan dengan mencocokkan ciri-ciri makroskopis tanaman Macaranga tanarius L.
Müll. Arg.. Determinasi dilakukan di bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
2. Pengumpulan bahan uji
Bahan uji yang digunakan adalah daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. yang memenuhi kriteria besar, berwarna hijau tua, tidak berbintik putih
yang dipetik dari daerah Paingan, Maguwoharjo, Sleman dan dipanen pada pagi hari agar tidak mengurangi kandungan metabolit sekunder daun
Macaranga tanarius L. Müll. Arg.
3. Pembuatan serbuk daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg.
Daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. dicuci bersih dengan air mengalir, diangin-anginkan, dipotong agar mempercepat proses pengeringan,
kemudian dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 29
o
C. Daun Macaranga tanarius
L. Müll. Arg. kering kemudian diserbuk menggunakan blender Miyako® dan diayak dengan ayakan nomor mesh 50.
4. Penetapan kadar air serbuk daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg.
Sebanyak 5 gram serbuk kering daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. yang sudah diayak, dimasukkan ke dalam alat moisture balance. Bobot
serbuk kering kulit tersebut ditetapkan sebagai bobot sebelum pemanasan bobot A, setelah itu dipanaskan pada suhu 110°C. Serbuk kering daun
Macaranga tanarius L. Müll. Arg. yang sudah dipanaskan ditimbang kembali
dan dihitung sebagai bobot setelah pemanasan bobot B. Selisih bobot A terhadap bobot B merupakan kadar air dari sampel serbuk daun Macaranga
tanarius L. Müll. Arg.
[ � � �
� −
� � � ℎ � � � �
� ] �
5. Pembuatan ekstrak metanol air daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg.
Sebanyak 40,0 gram serbuk daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. dimaserasi dengan pelarut metanol:air 1:1 sebanyak 200 mL selama 24 jam
menggunakan shaker dengan kecepatan 140 rpm untuk melarutkan senyawa yang diinginkan. Ekstrak cair yang diperoleh, kemudian disaring dengan
corong Buchner untuk memisahkan ekstrak cair dengan residunya. Ekstrak cair yang telah disaring, diuapkan menggunakan rotary vacuum evaporator dengan
suhu 80
o
C untuk mempercepat proses penguapan pelarut ekstrak. Setelah itu, ekstrak kental dituang ke dalam cawan porselen dan dipekatkan di oven dengan
suhu 50
o
C. Ekstrak kental pekat yang masuk ke tahap fraksinasi adalah ekstrak kental yang memiliki bobot penimbangan tetap selama 2-3 hari.
6. Pembuatan fraksi heksan-etanol ekstrak metanol daun Macaranga
tanarius L. Müll. Arg.
Ekstrak metanol air daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. difraksinasi menggunakan pelarut heksan:etanol 1:1 dengan perbandingan
ekstrak:pelarut adalah 1:5. Pemilihan heksan-etanol didasarkan pada kemiripan lipofilisitas senyawa tanin macatannin A, macatannin B, dan chebulogic acid
dengan lipofilisitas heksan-etanol yang dihitung menggunakan aplikasi MarvinSketch©. Fraksinasi dilakukan dengan maserasi ekstrak selama 24 jam
menggunakan shaker dengan kecepatan 140 rpm. Fraksi cair yang diperoleh, disaring dengan corong Buchner untuk memisahkan fraksi cair dengan
residunya. Fraksi cair dituang ke cawan porselen dan dipekatkan pada oven
dengan suhu 50
o
C. Fraksi yang digunakan adalah fraksi yang memiliki bobot
penimbangan tetap selama 2-3 hari. 7.
Pembuatan suspending agent CMC 1
Suspending agent CMC 1 dibuat dengan cara menimbang sebanyak
5,0 gram CMC dilarutkan menggunakan aquadest 200,0 mL dan didiamkan selama 24 jam hingga CMC mengembang. Suspensi tersebut kemudian
ditambahkan dengan aquadest hingga 500,0 mL pada labu ukur 500,0 mL.
8. Penetapan dosis karbon tetraklorida
Penelitian yang dilakukan oleh Janakat dan Al-Merie 2002 melaporkan bahwa dosis 2 mLKgBB dapat merusak sel-sel hati yang ditandai
dengan peningkatan kadar ALT dan AST 3-4 kali normal, namun pada dosis tersebut tidak menyebabkan kematian pada hewan uji. Hal ini juga didukung
oleh penelitian yang dilakukan oleh Wijayanti 2013 yang melaporkan bahwa induksi karbon tetraklorida 2 mLKgBB mampu meningkatkan kadar serum
ALT dan AST sebanyak tiga kali dari aktivitas serum awal.
9. Pembuatan karbon tetraklorida dalam olive oil
Hepatotoksin berupa karbon tetraklorida 2 mLKgBB yang dilarutkan dalam olive oil dengan perbandingan 1:1.
10. Pembuatan sediaan FHEMM
Sediaan suspensi FHEMM dibuat dengan menimbang sebanyak 600 mg fraksi kental yang disuspensikan dengan CMC 1 dan diadd pada labu takar
25 mL. Pada proses pembuatan suspensi FHEMM dibantu dengan sonicator selama 5-10 menit.
11. Penetapan dosis FHEMM
Penetapan dosis FHEMM dihitung dengan konsentrasi yaitu 600 mg25 mL dengan BB maksimal tikus 350 gram. Kemudian dibuat 3 peringkat
dosis dengan faktor kelipatan 2.
12. Penetapan waktu pencuplikan darah
Penetapan waktu pencuplikan darah yang diambil dari sinus orbitalis mata ditentukan melalui orientasi kadar ALT dan AST pada jam ke 0, 24, dan
48 setelah pemberian hepatotoksin dosis 2 mLkgBB secara i.p.. Menurut Janakat dan Al-Merie 2002 peningkatan aktivitas ALT dan AST maksimal
terjadi pada jam ke 24 setelah pemberian karbon tetraklorida 2 mLKgBB secara i.p..
13. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji
Sejumlah tiga puluh ekor tikus dibagi secara acak ke dalam enam kelompok perlakuan dengan masing-masing kelompok berisi lima ekor tikus.
a. Kelompok I atau kelompok kontrol pensuspensi FHEMM, yaitu kelompok yang diberikan CMC 1 secara p.o. dan diambil darahnya pada jam ke 6.
b. Kelompok II atau kelompok kontrol hepatotoksin diberi karbon tetraklorida
– olive oil dengan perbandingan 1:1 dan dosis 2 mLkgBB secara i.p. dan diambil darahnya pada jam ke 24.
c. Kelompok III atau kelompok kontrol dosis FHEMM diberi FHEMM dosis tinggi yaitu dosis 137,14 mgkgBB satu kali secara p.o. dan diambil
darahnya pada jam ke 6.
d. Kelompok IV atau kelompok perlakuan FHEMM diberi FHEMM dosis rendah yaitu dosis 34,28 mgkgBB satu kali, enam jam setelah pemberian
FHEMM kemudian diberikan karbon tetraklorida – olive oil dosis 2
mLKgBB secara i.p. e. Kelompok V atau kelompok perlakuan FHEMM diberi FHEMM dosis
sedang yaitu dosis 68,57 mgkgBB satu kali, enam jam setelah pemberian FHEMM kemudian diberikan karbon tetraklorida
– olive oil dosis 2 mLKgBB secara i.p.
f. Kelompok VI atau kelompok perlakuan FHEMM diberik FHEMM dosis tinggi yaitu dosis 137,14 mgkgBB 1 kali, kemudian 6 jam setelah
pemberian FHEMM diberikan karbon tetraklorida – olive oil dosis 2
mLKgBB 1:1 secara i.p.. Pencuplikan darah semua kelompok perlakuan melalui sinus orbitalis
mata. Pencuplikan darah kelompok IV-VI perlakuan FHEMM yaitu 24 jam setelah pemberian hepatotoksin 2 mLKgBB secara i.p..
14. Pemeriksaan sampel darah
Pemeriksaan sampel darah dan penetapan aktivitas serum ALP dilakukan di Laboratorium Pusat Rumah Sakit Bethesda Yogyakarta.
Pemeriksaan sampel darah menggunakan reagen ALP Thermo Scientific dengan metode International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory
Medicines IFCC. Cara pembuatan serum darah adalah sebagai berikut.
a. Sampel darah vena diambil sebanyak 2-3 mL dan dimasukkan ke dalam tabung vaccum.
b. Sampel darah dibiarkan membeku ±15 – 30 menit.
c. Tabung disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit. d. Diambil bagian serum yaitu pada lapisan atas, kemudian dilakukan
pemeriksaan kadar ALP.
F. Tata Cara Analisis Hasil
Kategori