Hewan Uji TINJAUAN PUSTAKA

20 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian I, Laboratorium BiokimiaPatologi Klinik dan Animal House Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pada bulan Februari hingga Mei 2015.

3.2 Alat dan Bahan Penelitian

3.2.1 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : blender, timbangan, rotary evaporator, oven, timbangan analitik, waterbath, hot plate, bejana maserasi, cawan porselenpenguap, pipet tetes, kertas label, kapas, kertas saring, aluminium foil, batang pengaduk, spatula, corong, penjepit kayu, gelas piala, tabung reaksi, erlenmeyer, spatula, gelas ukur, labu ukur, rak tabung reaksi, sonde, sample tube, tabung EDTA, pipa kapiler, spuit 3 ml, sentrifugasi, spektrofotometer UV, TLC-Scanner Camag, Plat KLT, masker, sarung tangan, kandang tikus, tempat makan dan botol minum tikus.

3.2.2 Bahan

Bahan Uji : Simplisia herba kumis kucing Orthosiphon stamineus Benth yang diperoleh dari Pusat Pengembangan Tanaman Obat Karyasari. Hewan Uji : 36 ekor tikus putih galur Sprague-Dawley yang berumur ± 3 bulan dengan berat badan sekitar 150-250 gram. Bahan Kimia : Reagen Kit Cholesterol PAP SL dari Elitech Clinical Systems, etanol 96, toluen, metanol, etil asetat, NaCMC 1, eter, pereaksi Libermann-Burchard 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes H 2 SO 4 pekat, FeCl 3 , HCl pekat, kloroform, amilalkohol, tablet simvastatin 10 mg dari Kimia Farma. 20 21 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Bahan penginduksi hiperkolesterol : Makanan tinggi kolesterol dibuat dengan komposisi kuning telur 80, larutan sukrosa 65 dalam air 15, dan lemak hewan 5 Purwanti, 2012. Bahan lainnya : aquadest dan makanan tikus G511

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Pembuatan Ekstrak

Metode pembuatan ekstrak herba kumis kucing adalah dengan cara maserasi dalam pelarut etanol 96. Sebelum melakukan proses maserasi, simplisia herba kumis kucing yang telah di sortasi kering, dihaluskan terlebih dahulu dengan blender. Serbuk yang diperoleh ditimbang sebanyak 1500 gram dan dimasukkan kedalam bejana maserasi, kemudian ditambahkan etanol 96 kedalam bejana tersebut kurang lebih hingga 2 cm di atas permukaan serbuk. Maserat diaduk rata dan kemudian mulut bejana maserasi ditutup dengan aluminium foil. Perendaman dilakukan selama 3 hari pada suhu kamar dan pengadukan dilakukan setiap harinya 2-3 kalihari. Setelah 3 hari, maserat disaring dengan kertas saring dan kapas. Ampas hasil maserasi direndam lagi dengan etanol 96 selama 3 hari selanjutnya perlakuan sama dengan maserasi pertama. Filtrat yang diperoleh dari hasil penyaringan maserat kentalkan dengan vakum rotary evaporator. Ekstrak yang didapatkan berupa ekstrak kental. Selanjutnya ekstrak kental dikeringkan dengan oven vakum di laboratorium fitokimia Universitas Indonesia selama 5 hari hingga didapatkan ekstrak kering.

3.3.2 Penapisan Fitokimia

1. Identifikasi golongan alkaloid

Sebanyak 0,5 gram ekstrak dilarutkan dalam larutan HCl encer kemudian disaring. Larutan ammonia sebanyak 2 ml ditambahkan kedalam filtrat, kemudian ditambahkan kloroform 5 ml dan dikocok perlahan-lahan untuk mengekstraksi basa alkaloid. Lapisan kloroform diambil lalu diekstraksi dengan 10 ml asam asetat, kemudian dibagi menjadi 2 bagian. Pada bagian pertama ditambahkan reagen Mayer dan bagian kedua 22 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta ditambahkan reagen Dragendorff. Terbentuk warna krem dengan reagen Mayer dan endapan coklat kemerahan dengan reagen Dragendorff menunjukkan adanya senyawa golongan alkaloid Ayoola et al., 2008

2. Identifikasi golongan flavonoid

0,5 gram ekstrak ditambah 50 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring, filtrat digunakan sebagai larutan percobaan. 5 ml larutan percobaan ditambahkan sedikit serbuk magnesium, 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amilalkohol, dikocok dengan kuat dan dibiarkan memisah, terbentuknya warna orange, merah, kuning pada lapisan amilalkohol menunjukkan adanya senyawa flavonoid Wijono, 2003.

3. Identifikasi golongan saponin

0,5 gram ekstrak dimasukkan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan aquadest, larutan dikocok secara vertikal selama 3-5 menit. Terbentuknya busa yang stabil selama 30 menit menunjukkan adanya senyawa golongan saponin Farnsworth, 1966

4. Identifikasi golongan tanin

0,5 gram ekstrak dididihkan dalam 10 ml aquadest dalam tabung reaksi, lalu disaring. Kemudian kedalam filtrat ditambahkan 3 tetes larutan FeCl 3 . Terbentuk warna hijau kecoklatan atau biru kehitaman menunjukkan adanya tanin Ayoola et al., 2008

5. Identifikasi golongan steroid dan triterpenoid

0,5 gram ekstrak ditambahkan 2 ml kloroform, kemudian 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Libermann-Burchard. Jika terbentuk warna hijau kehitaman menunjukkan adanya golongan steroid dan jika terbentuk warna merah yang cepat hilang menunjukkan adanya senyawa golongan triterpenoid Ayoola et al., 2008. 23 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.3 Pengujian Parameter Ekstrak

1. Parameter Spesifik

a. Identitas

Diidentifikasi dengan tata nama yang meliputi nama ekstrak, nama latin tumbuhan, bagian tumbuhan yang digunakan, dan nama Indonesia tumbuhan Depkes, 2000.

b. Organoleptik

Diidentifikasi menggunakan panca indera untuk mengetahui bentuk, warna, bau, dan rasa Depkes, 2000. c. Pengukuran Kadar Sinensetin Ekstrak ditimbang sebanyak 0,2 gram dilarutkan dalam etanol 96 dalam labu ukur 10 ml larutan ekstrak 2. Selanjutnya standar sinensetin 10 ppm ditotolkan pada plat KLT ukuran 6x10 cm dengan seri volume 10 µL; 30 µL;50µ L; dan 70 µL. Masing-masing ditotolkan pada titik totolan 1- 4 secara berurutan dan sampel ekstrak 2 ditotolkan pada titik ke-5 dengan volume 20 µl. Plat KLT dieluasi dengan eluen metanol : etil asetat : toluen 5:40:55 yang telah jenuh didalam wadah yang tertutup rapat. Plat KLT kemudian dikeringkan dan dilihat bercak hasil elusi pada lampu UV dengan panjang gelombang 365 nm British Pharmacopoeia Commission, 2009. Plat KLT dimasukkan ke dalam alat TLC-Scanner Camag dan ditentukan luas area puncak bercak standar dan sampel pada panjang gelombang maksimum yang dikontrol melalui komputer dengan program software winCATS. Selanjutnya dibuat kurva kalibrasi dari perbandingan volume penotolan terhadap luas area puncak dan ditentukan persamaan regresinya. Persamaan regresi yang diperoleh digunakan untuk menentukan kadar sinensetin pada sampel ekstrak.

2. Parameter Non-Spesifik

a. Susut Pengeringan Ekstrak ditimbang sebanyak 1 gram dan dimasukkan kedalam botol timbang dangkal tertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105 o C selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum ditimbang ekstrak 24 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta diratakan dalam botol timbang dengan bantuan batang pengaduk, kemudian dimasukkan kedalam oven. Sebelumnya tutup botol timbang dibuka dan dikeringkan pada suhu 105 o C hingga bobot tetap. Sebelum pengeringan, biarkan botol dalam keadaan tertutup dalam desikator pada suhu kamar Depkes, 2000. b. Kadar Abu Total 1 gram ekstrak yang telah digerus dan ditimbang, dimasukkan kedalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara, kemudian diratakan. Pijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, dinginkan, timbang Depkes, 2000.

3.3.4 Penyiapan Hewan Uji