Efek genomik estrogen melalui reseptor estrogen Kerangka Teori Kerangka Konsep

Produksi estrogen yang meningkat terhadap jaringan bekerja melalui dua jalur yaitu:

a. Efek genomik estrogen melalui reseptor estrogen

Aktivasi reseptor estrogen berakibat pada transkripsi melalui jalur aktivasi genetika. Reseptor estrogen memiliki N terminal DNA-binding domain dan C-terminal ligand binding domain. Terdapat dua subtype reseptor estrogen yang mengkode gen yang berbeda, dan akan memberi dampak jaringan yang berbeda pula, yaitu reseptor alpa dan beta. Secara normal reseptor estrogen alpa terdapat di endometrium, sel kanker payudara dan stroma ovarium. Sedangkan reseptor estrogen beta terdapat di sel granulosa, spermatid, ginjal, mukosa intestinal, parenkim paru, sumsum tulang, sel endotel dan prostat. Kompleks estrogen-reseptor kemudian ditranslokasi kedalam inti sel, yang berikatan dengan homodimer atau heterodimer kepada sekuens DNA spesifik, yang akan meregulasi transkripsi. 32

b. Efek non genomik estrogen

Beberapa efek estrogen dapat berlangsung cepat langsung melakukan transkripsi non genom, dimana estrogen berikatan dengan reseptor estrogen pada membran sel sebagian besar reseptor untuk aksi ini belum dapat diidentifikasi. Dampak ikatan ini akan mengaktivasi enzim intraseluler. Salah satu efek non genomik estrogen ini adalah Universitas Sumatera Utara efek estrogen terhadap vaskuler dan aktivasi mediator faktor pertumbuhan. Dimana estrogen dapat mengakibatkan vasodilatasi sementara. 32

2.2.2. Aromatase P450

Adalah suatu enzim yang mengkatalis androstenedion menjadi estrone. Aromatase P450 dihasilkan oleh gen Cyp 19A dan termasuk kedalam cytocrome hemo-protein enzime complex. Gen Cyp19 p450arom berlokasi pada regio 21,2 pada lengan panjang kromosom 14 15q21.2. Gen ini terdiri dari 30 kode genetik dan 93 regio regulasi total panjang sekitar 123 kb. Regio regulasi ini dibedakan atas 10 promoter yang meregulasi signal jaringan yang spesifik. Setiap promoter meregulasi sekuens DNA yang spesifik. Pada manusia terdapat sekitar 8 dari 10 promoter. Promoter spesifik digunan untuk regulasi organ gonad, tulang, otak, vaskuler, lemak, kulit, hepar fetal, dan plasenta untuk biosintesa estrogen manusia yang spesifik. 32,33 Berbagai subset enzim sitokrom P450 memegang peran penting dalam jaringan adrenal, gonad atau jaringan perifer, yaitu: • CYP11A1 juga dikenal sebagai P450scc or P450c11a1 terdapat dalam mitochondria adrenal, efek yang ditimbulkan adalah “aktifitas yang sebelumnya diketahui sebagai 20,22-desmolase” steroid 20α-hydroxylase, steroid 22-hydroxylase, cholesterol side chain scission. 32 Universitas Sumatera Utara • CYP11B1 encoding protein P450c11β ditemukan dalam membran dalam mitokondria korteks adrenal, memiliki steroid 11β-hydroxylase, steroid 18-hydroxylase, and steroid 18- methyloxidase activitas. • CYP11B2 encoding protein P450c11AS, ditemukan hanya dalam mitokondria zona glomerulosa adrenal, memiliki aktifitas steroid 11β-hydroxylase, steroid 18-hydroxylase, and steroid 18- methyloxidase. • CYP17A1, di dalam retikulum endopasmik korteks adrenal, memiliki aktifitas steroid 17α-hydroxylase and 17,20-lyase. • CYP21A1 P450c21 didalam korteks adrenal melakukan aktifitas 21-hydroxylase. • 33 CYP19A P450arom, aromatase berada dalam retikulum endoplasmik gonad, otak, adipose, dan tempat lain yang mengaktalisasi aromatisasi androge ke estrogen. Aktifitas aromatase P450 pada endometriosis akan meningkatkan kadar 17 β estradiol, yang kemudian merangsang sintesis prostaglandin synthase-2 cox-2, yang meningkatkan konsentrasi PGE2, sitokin imunologi IL1, Tumor Nekroting Factor α. 34,35 Universitas Sumatera Utara Gambar 9: Ilustrasi biokimia aromatase P450 Pada sisi aktif aromatase P450 mengandung satu heme berpusat pada besi. Besi tersebut berikatan dengan protein P450 melalui ligan tiolat yang berasal dari residu sistei . Sistein ini dan beberapa residu mengapit dilkenal dengan CYPs dan memiliki pola yang lazim prosite dengan pola [ FW ] - [ SGNH ] - x - [ GD ] - { F } - [ RKHPT ] - { P } - C - [ LIVMFAP ] - [ GAD ] Karena berbagai macam reaksi yang dikatalisasi oleh CYPs , aktivitas dan sifat dari berbagai CYPs berbeda- beda dalam banyak aspek. Secara umum, siklus katalitik P450 berlangsung sebagai berikut: • 30 Substrat berikatan dengan situs aktif enzim, di dekat kelompok heme, di sisi yang berlawanan dengan rantai peptida. Substrat yang terikat tersebut menginduksi perubahan konformasi dari situs aktif, sering mengalihkan molekul air dari posisi koordinasi aksial Universitas Sumatera Utara distal besi heme, dan kadang-kadang mengubah besi heme dari - spin rendah ke spin tinggi. Hal ini menimbulkan perubahan dalam sifat spektral enzim, dengan peningkatan absorbansi pada 390 nm dan penurunan pada 420 nm. Hal ini dapat diukur dengan perbedaan spektrometri dan disebut sebagai perbedaan spektrum tipe I . • 31 Perubahan elektronik dari tempat aktif memungkinkan transfer elektron dari NAD P H melalui sitokrom P450 reduktase atau reduktase lain. Hal ini terjadi dengan cara transfer elektron, mengurangi besi heme Fe ke keadaan Fe. 33 • • Molekul Oksigen berikatan kovalen pada posisi koordinasi aksial distal dari besi heme. Ligan sistein adalah donor elektron yang lebih baik dari histidin, dengan akibatnya oksigen yang diaktifkan pada tingkat yang lebih besar daripada di protein heme lainnya. Namun, terkadang hal ini memungkinkan ikatan, yang disebut reaksi decoupling , melepas superoksida radikal reaktif yang mengganggu siklus katalitik. Elektron kedua ditransfer melalui sistem transpor elektron, baik dari reduktase sitokrom P450, ferredoxins, atau sitokrom b5, mengurangi oksigen ke grup perokso bermuatan negatif.Kelompok perokso terbentuk pada langkah 4 dengan cepat terprotonasi dua kali oleh transfer lokal dari air atau dari sekitarnya rantai samping asam amino, melepaskan satu molekul air, dan membentuk besi sangat reaktif V -okso spesies. 32 Universitas Sumatera Utara •

2.2.3. Imunohistokimia Aromatase P450

Tergantung pada substrat dan enzim yang terlibat, enzim P450 dapat mengkatalisis salah satu dari berbagai macam reaksi. Setelah produk dilepas dari situs aktif, enzim akan kembali ke kondisi semula, dengan molekul air kembali menempati posisi distal dari inti besi. Imunohistokimia adalah sebuah metoda pemeriksaan dengan menggunakan prinsip antibodi dengan spesifikasi yang tinggi untuk menunjukkan lokasi dan keberadaan sebuah protein di dalam jaringan. Pemeriksaan IHC dapat dilakukan terhadap jaringan langsung ataupun parafin. Prinsip IHC meliputi langkah: 17 1. Fixing and embedding jaringan 36 2. Cutting and mounting jaringan 3. Deparafinizing and rehydrating jaringan yang telah dilakukan diseksi 4. Antigen retrieval 5. Pewarnaan Immunohistokimia 6. Counterstaining 7. Dehidrasi dan stabilisasi dengan medium mounting 8. Pengamatan pewarnaan dibawah mikroskop. Pewarnaan imunohistokimia menggunakan antigen tertentu. Pada pemeriksaan IHC diperlukan kontrol positif, yaitu kontrol pada Universitas Sumatera Utara waktu pewarnaan dari jaringan yang memiliki aktifitas enzim aromatase, seperti plasenta aterm. Gambar 10. Tampilan imununohistokimia aromatase P450 pada endometriosis a-c, peritoneal endometriotik d, eutopic endometrium e, dan leiomioma f diambil dari literatur 8 Hasil pemeriksaan imunohistokimia tersebut diinterpretasikan berdasarkan gabungan antara kualitas intensitas ikatan antigen dengan antibody yang terbentuk di sitoplasma atau inti sel dengan persentase sel yang terwarnai dalam lapang pandang. Universitas Sumatera Utara Tabel 2.2. Metode Skoring Quantitatif Imunohistokimia 35 Interpretasi hasil imunohistokimia dapat dilakukan dengan salah satu metode diatas. Universitas Sumatera Utara

2.3. Kerangka Teori

TIAR, reflux haid, choelem, imuninologi Genetik Faktor Interleukin 6 dan 18 COX -2 PgE2 P450 arom Chlosterol uptake ↑ STAR Testosterone Estradiol 17β Growth Factor, inflamasi, imunologi. Reseptor E2 ↑ Aktifitas estrogen lokal ↑ Endometriosis Universitas Sumatera Utara

2.4. Kerangka Konsep

Variabel independent Variabel dependent Faktor-faktor yang mempengaruhi Endometrium ektopik penderita endometriosis Ekspresi Aromatase P450 Endometrium normal Usia Fase menstruasi Penyakit tergantung endometriosis Kontrasepsi Universitas Sumatera Utara

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini adalah penelitian case control dengan pemeriksaan imunohistokimia terhadap parafin blok jaringan endometrium ektopik penderita endometriosis dan parafin blok jaringan endometrium normal untuk melihat perbedaan ekspresi enzim aromatase P450.

3.2. Waktu dan Tempat penelitian

Tempat penelitian di lakukan di departemen Obstetri dan Ginekologi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara – RSUP H Adam Malik Medan, sedangkan pemeriksaan imunohistokimia dilakukan oleh departemen Patologi Anatomi Universitas Sumatera Utara Medan. Penelitian ini dilakukan mulai Agustus 2013 hingga Januari 2014.

3.3. Subjek Penelitian

Subjek penelitian kelompok kasus adalah parafin blok jaringan endometrium ektopik penderita endometriosis yang diperoleh dari laparatomi dan laparaskopi. Sedangkan subjek penelitian kelompok kontrol adalah parafin blok jaringan endometrium normal, yang diperoleh dari histererektomi dengan diagnosa kanker leher rahim. Universitas Sumatera Utara