29
3.1 Alat-alat
Timbangan hewan, neraca analitik, lemari pengering, perkolator, rotary evaporator, alat-alat gelas laboratorium pyrex, aluminium foil, micropipette
thermoscientific, spuit injeksi terumo, sonde lambung, centrifugevelocity, incubator thermoscientific, mikroskop cahaya boeco, objek glass, tabung
reaksi pyrex, rak tabung reaksi, spektrofotometer UV Thermoscientific.
3.2 Bahan-bahan
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah serbuk simplisia rimpang temu giring Curcuma heyneana. Bahan-bahan kimia yang digunakan
adalah etanol 96, air suling, CMC Na 0,5, parasetamol, katekin, reagen kit ALT Dyasis®, reagen kit AST Dyasis®, buffer formalin 10, dan zat warna
hematoksilin dan eosin.
3.3 Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih jantan Rattus novergicusgalur Wistar, berat badan 150-200 gram sebanyak 35
ekor dengan kondisi sehat. Hewan diaklimatisasi selama 1 minggu dengan tujuan untuk menyeragamkan makanan dan hidupnya dengan kondisi yang serba sama
sehingga dianggap memenuhi syarat penelitian.
3.4 Pengambilan sampel
Pengambilan sampel berupa serbuk simplisiadilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain.
Sampel diperoleh dari kebun PT. Sumatera Busan yang terletak didesa Sei Mencirim,kecamatan Diski Deli Serdang.
Universitas Sumatera Utara
30
3.5 Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan organoleptik, makroskopik dan mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar abu total,
penetapan kadar abu tidak larut asam, penetapan kadar sari larut dalam air, dan penetapan kadar sari larut dalam etanol Ditjen POM, 1989.
3.5.1 Pemeriksaan Organoleptis dan Makroskopik
Pemeriksaan organoleptis dilakukan terhadap simplisia meliputi pemeriksaan warna, bau, dan rasa. Pemeriksaan makroskopik terhadap simplisia
meliputi pemeriksaan bentuk, diameter, ketebalan, dan tekstur.
3.5.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik terhadap serbuk simplisia dilakukan dengan cara meneteskan larutan kloralhidrat di atas kaca objek, kemudian di atasnya
diletakkan serbuk simplisia, lalu ditutup dengan kaca penutup dan dilihat di bawah mikroskop.
3.5.3 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, alat penampung, pendingin, tabung
penyambung, dan tabung penerima 5 ml. Cara kerja: toluen sebanyak 200 ml dan air suling sebanyak 2 ml
dimasukkan ke dalam labu alas bulat. Kemudian didestilasi selama 2 jam, toluen didinginkan selama 30 menit, dan dibaca volume air dengan ketelitian 0,05 ml
volume awal. ke dalam labu alas bulat tersebut kemudian dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang dengan seksama, kemudian labu
dipanaskan dengan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mulai mendidih,
Universitas Sumatera Utara
31
didestilasi dengan kecepatan 2 tetes tiap detik hingga sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi ditingkatkan hingga 4 tetes tiap detik.
Setelah semua air terdestilasi, bilas bagian dalam pendingin dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian labu penerima dibiarkan
mendingin pada suhu kamar dan dibersihkan tetesan air yang mungkin masih terdapat pada dinding tabung penerima. Setelah air dan toluen memisah sempurna,
dibaca volume air dengan ketelitian 0,05 ml Volume I. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang
diperiksa, dan destilasi dilanjutkan lagi sebagi volume II.Lakukan pengulangan sekali lagi Volume III. Hitung kadar air dalam persen.
3.5.4 Penetapan Kadar Abu Total
Caranya: sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian
diratakan. Krus porselin dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu 600°C selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang
sampai diperolehbobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM, 1989.
3.5.5 Penetapan Kadar Abu Tidak Larut Dalam Asam
Caranya: Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam
asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring, dipijar sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam
dihitung terhadap bahan yang dikeringkan di udara Ditjen POM, 1989.
Universitas Sumatera Utara
32
3.5.6 Penetapan Kadar Sari Larut Air
Caranya: sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling
sampai 1 liter dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudiam dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Sejumlah 20 ml
filtratpertama diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105°C sampai bobot
tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM, 1989.
3.5.7 Penetapan Kadar Sari Larut Etanol
Caranya: sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 95 dalam labu bersumbat sambil dikocok
sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat
diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan danditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105°C sampai bobot tetap.
Kadar dalam persen sari larut dalam etanol 95 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM, 1989.
Universitas Sumatera Utara
33
3.6 Skrining Fitokimia 3.6.1 Pemeriksaan Alkaloida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambah 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit.
Dingin dan disaring. Filtrat digunakan untuk percobaan berikut: a.
Filtrat sebanyak 3 tetes ditamabah dengan 2 tetes larutan peraksi Mayer, akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning
b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan
berwarna coklat sampai hitam. c.
Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes pereaksi Dragendorff, akan terbentuk warna merah atau jingga.
Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari ketiga percobaan di atas Ditjen POM, 1989.
3.6.2 Pemeriksaan Flavonoida
Sebanyak 0,5 g simplisia disari dengan 10 ml metanol, lau direfluks selama 10 menit. Kemudian disaring panas-panas melalui kertas saring kecil
berlipat. Filtrat diencerkan dengan 10 ml air. Setelah dingin ditambahkan 5 ml eter, dikocok hati-hati dan didiamkan. Lapisan methanol diambil, lalu diuapkan
pada suhu 40°C, sisanya dilarutkan dalam 5 ml etil asetat, disaring. Filtrat digunakan untuk uji flavonoida dengan cara berikut:
a. Sebanyak 1 ml larutan percobaan diuapkan hingga kering, sisa dilarutkan
dalam 1 sampai 2 ml etanol 95, lalu ditambahkan 0,5 g serbuk seng dan 2 ml HCl 2 N, didiamkan selama 1 menit. Ditambahnkan 10 ml HCl
p
, dalam
Universitas Sumatera Utara
34
waktu 2 sampai 5 menit terjadi warna merah intensif, menunjukkan adanya flavonoida.
b. Sebanyak 1 ml larutan percobaan diuapkan hingga kering, sisa dilarutkan
dalam 1 ml etanol 95, lalu ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 10 ml HCl
p
3.6.3 Pemeriksaan Saponin
, terjadi warna merah jingga, menunjukkan adanya flavonoida Ditjen POM, 1989.
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia, dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan air panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik.
Jika terbentuk buih yang mantap setinggi 1 sampai 10 cm, tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan asam klorida 2 N menunjukkan
adanya saponin Ditjen POM, 1989.
3.6.4 Pemeriksaan Glikosida
Disari 3 g serbuk simplisia dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air 7:3 dan 10 ml asam sulfat 2 N. Direfluks selama 1 jam, didinginkan dan
disaring. Pada 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok dan didiamkan selama 5 menit, disaring. Disaring filtrat 3 kali, tiap kali dengan 20
ml campuran kloroform-isopropanol 3:2. Sari air digunakan untuk percobaan berikutnya yaitu 0,1 ml larutan percobaan dimasukkan ke dalam tabung reaksi,
duapkan di atas penangasair, sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish. Tambahkan 2 ml dengan hati-hati asam sulfat pekat melalui dinding
tabung, terbentuknya cincin ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya glikosida Ditjen POM, 1995.
Universitas Sumatera Utara
35
3.6.5 Pemeriksaan Tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia, disari dengan 10 ml air suling lalu dipanaskan, disaring. Filtratnya diencerkan dengan air sampai ridak berwarna.
Larutan diambil sebanyak 2ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru atau hijau kehitaman, menunjukkan adanya
tannin Ditjen POM, 1989.
3.6.6 Pemeriksaan Steroida dan Triterpenoida
Sejumlah 1 g serbuk dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan di cawan penguap. Sisanya ditambahkan asam asetat anhidrat dan
asam sulfat pekat Pereaksi Liebermann-Burchard. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah menjadi biru ungu atau biru hijau menunjukkan adanya
steroidatriterpenoida Ditjen POM, 1989.
3.7 Pembuatan Ekstrak Etanol Rimpang Temu giring EERTG
Pembuatan ekstrak etanol rimpang temu giring dilakukan secara perkolasi dengan pelarut etanol 96. Sebanyak 500 g serbuk simplisia temu giring
dimasukkan kedalam bejana tertutup, cairan penyari dituangi sampai semua simplisia terendam, biarkan sekurang-kurangnya selama 3 jam. Pindahkan massa
sedikit demi sedikit kedalam perkolator sambil tiap kali ditekan hati-hati, tuangi cairan penyari secukupnya sampai cairan mulai menetes dan diatas simplisia
masih terdapat selapis cairan penyari, tutup perkolator, biarkan selama 24 jam. Biarkan cairan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit, tambahkan berulang-
ulang cairan penyari hingga diatas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari, tutup perkolator, biarkan selama 24 jam. Perkolasi dihentikan jika perkolat yang
keluar telah jernih Ditjen POM, 1979. Perkolat yang diperoleh dipekatkan
Universitas Sumatera Utara
36
dengan alat penguap vakum putar rotary evaporator sampai sebagian besar pelarutnya menguap, dan dilanjutkan proses penguapan di atas penangas air
sampai diperoleh ekstrak kental.
3.8Pemeriksaan Karakterisasi Ekstrak
Pemeriksaan karakterisasi ekstrak meliputi penetapan kadar air, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu tidak larut dalam asam Ditjen POM, 2000.
3.8.1 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan menurut metode Azeotropi destilasi toluen. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, pendingin, tabung penyambung dan
tabung penerima 5 ml berskala 0,05 ml, alat penampung dan pemanas listrik. Cara kerja:
Dimasukkan 200 mltoluen dan 2 ml air suling ke dalam labu alas bulat, lalu didestilasi selama 2 jam. Setelah itu, toluen dibiarkan mendingin selama 30 menit,
dan dibaca volume air pada tabung penerima dengan ketelitian 0,05 ml volume awal. Kemudian ke dalam labu alas bulat tersebut dimasukkan 5 g
ekstrak yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik
sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan tetesan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik.Setelah 2 jam didestilasi semua air terdestilasi, bagian
dalam pendingin dibilas dengan toluen yang telah dijenuhkan. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada
suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml volume I, dilakukan pengulangan dua kali lagi. Selisih kedua
Universitas Sumatera Utara
37
volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen Ditjen POM, 1995.
3.8.2 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g ekstrak dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, jika
arang masih tidak dapat dihilangkan, ditambahkan air panas, saring melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa dan kertas saring dalam krus yang sama.
Masukkan filtrat ke dalam krus, uapkan, pijarkan hingga bobot tetap, timbang.
Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Ditjen POM, 1995. 3.8.3 Penetapan kadar abu tidak larut dalam asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan,
disaring melalui kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas, dipijarkan, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu yang tidak
larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan.
3.9Pembuatan CMC 0,5
Pembuatan suspensi CMC 0,5 bv dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 0,5 gram CMC ditaburkan kedalam lumpang yang berisi air
suling panas sebanyak 10 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh masa yang transparan, digerus hingga terbentuk gel dan diencerkan dengan sedikit air
suling, kemudian dituang ke dalam labu tentukur 100 ml, ditambah air suling sampai batas tanda. Larutan ini digunakan sebagai pembawa parasetamol dan
ekstrak.
Universitas Sumatera Utara
38
3.10 Pembuatan suspensi Ekstrak Etanol Rimpang Temu Giring EERTG
Pembuatan suspensi EERTG 5 bv dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 1,25 gram EERTG dimasukkan kedalam lumpang, kemudian
ditambahkan sedikit demi sedikit CMC 0,5 sambil digerus sampai homogen. Masukkan suspensi EERTG kedalam labu tentukur, tambahkan CMC 0,5
sampai 25 ml.
3.11 Pembuatan Suspensi dan Penentuan Dosis Parasetamol 20
Suspensi parasetamol dalam CMC 0,5 dibuat dengan cara melarutkan 10 gram serbuk parasetamol yang telah ditimbang ke dalam CMC 0,5 di dalam
lumpang, digerus hingga homogen, kemudian di encerkan dengan sebagian larutan CMC 0,5. Masukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, cukupkan
volumenya dengan larutan CMC 0,5 sampai garis tanda. Dosis parasetamol dipilih berdasarkan dosis hepatotoksiknya terhadap tikus yaitu 2gkg bb Donatus
et al., 1983; Parmar, 2006.
3.12 Pembuatan Larutan Katekin 0,01
