Prosedur Penelitian METODE PENELITIAN

23 mL 0,1 M buffer fosfat pH 7,0; 8,0; dan 9,0 dengan cara dipanaskan ± 20 menit sambil diaduk perlahan. Untuk menjaga agar konsentrasi tetap ditambahkan 10 mL akuades sebagai pengganti air yang menguap. h. ZnSO 4 variasi konsentrasi: 0,0010 M; 0,0015 M; 0,0020 M; 0,0025 M; dan 0,0030 M yang dibuat dari larutan induk 0,01 M Larutan induk ZnSO 4 0,01 M dibuat dengan melarutkan 0,163 gram ZnSO 4 dalam 100 mL akuades. i. Akuades

D. Prosedur Penelitian

Penelitian ini menggunakan metode Lowry untuk menentukan konsentrasi protein dan penentuan aktivitas enzim tripsin dengan metode Anson. Prosedur kerja dilakukan dengan langkah sebagai berikut:

1. Penentuan Kadar Protein Baku Kasein dengan Metode Lowry

Kadar protein baku kasein diukur dengan metode Lowry Lowry, O. H., et al., 1951. Prosedur pengukuran kadar protein sebagai berikut: Gambar 11. Bagan Prosedur Penentuan Kadar Protein 0,2 mL Larutan sampel protein 5-100 µg Ditambah 1 mL Reagen C Dikocok Diamkan 10 menit pada suhu kamar Ditambah 0,1 mL Reagen E Dikocok Diamkan 30 menit pada suhu kamar Ukur absorbansi pada panjang gelombang tertentu 24

a. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Pengukuran panjang gelombang maksimum menggunakan larutan kasein 1 mgmL yang dilarutkan dalam buffer fosfat pH 8. Pengamatan panjang gelom- bang maksimum dilakukan dengan pengukuran absorbansi pada λ 650-750 nm. Penelitian dilakukan dengan mengacu pada prosedur Lowry dengan sedikit perubahan. Pada penelitian digunakan 1 mL larutan sampel kasein 1 mgmL, 5 mL reagen C, dan 0,5 mL reagen E. Bagan cara kerja dapat dilihat dalam bentuk bagan pada Lampiran 1.

b. Penentuan Kurva Standar Protein Kasein

Penentuan kurva standar protein kasein dilakukan dengan prosedur yang sama seperti lampiran 1. Hasil panjang gelombang maksimum digunakan untuk mengukur absorbansi dari variasi konsentrasi sampel, yaitu kasein: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; dan 1 mgmL. Prosedur ini dilakukan sebanyak tiga kali triplo. Bagan cara kerja dapat dilihat dalam bentuk bagan pada Lampiran 2.

2. Penentuan Kadar Protein Tripsin

Tripsin sebanyak 8 mg dilarutkan ke dalam 20 mL larutan buffer fosfat pH = 8 untuk menentukan kadar protein perlakuannya sama seperti Lampiran 1, tetapi larutan kasein diganti dengan larutan tripsin sebanyak 1 mL. Prosedur ini dilakukan sebanyak tiga kali triplo. Bagan cara kerja dapat dilihat dalam bentuk bagan pada Lampiran 3. 25 5 mL substrat Ditambah 1 mL enzim Diaduk Setelah 10 menit, ditambah 10 mL 0,3 N TCA Dikocok Suspensi disaring Setelah 30 menit 5 mL Filtrat TCA Ditambah 10 mL 0,5 N NaOH Ditambah 3 mL reagen fenol Baca serapan Setelah 2 - 10 menit

3. Penentuan Aktivitas Enzim Tripsin dengan Metode Anson

Penentuan aktivitas enzim tripsin dilakukan dengan metode Anson. Menurut M. L. Anson 1938, prosedur penentuan aktivitas enzim tripsin dari metode Anson sebagai berikut: Standar Sampel Blanko Gambar 12. Bagan Prosedur Penentuan Aktivitas Enzim Tripsin dengan Metode Anson 1 mL enzim Ditambah 10 mL 0,3N TCA Diaduk Ditambah 5 mL substrat, 1 mL air, 1 mL tirosin Dikocok Suspensi disaring Setelah 30 menit 5 mL Filtrat TCA Ditambah 10 mL 0,5 N NaOH Ditambah 3 mL reagen fenol Baca serapan Setelah 5 menit 5 mL tirosin Ditambah 10 mL 0,5 N NaOH Ditambah 3 mL reagen fenol Baca serapan Setelah 5 menit 26 Prosedur tersebut dilakukan untuk menghitung unit aktivitas enzim tripsin dari nilai warna filtrat pencernaan pada miliekivalen tirosin. Substrat yang diguna- kan adalah campuran hemoglobin dan buffer fosfat pH 7,5 serta reagen yang lain. Pada standar dan blanko menggunakan 0,0008 miliekuivalen tirosin dalam 5 mL 0,2 N asam klorida dan 0,5 formaldehid sebagai pengawet. Pada penelitian ini prosedur metode Anson tersebut digunakan untuk menentukan aktivitas dari enzim tripsin dengan melakukan beberapa modifikasi. Prosedur metode Anson termodifikasi yang digunakan mengacu pada prosedur modifikasi dari Togu Gultom dan Eddy Sulistyowati 2012: 42 - 43 dengan digunakan TCA 10 yang dapat dilihat pada bagan di Lampiran 4.

a. Penentuan pH Optimum

Menyiapkan beberapa tabung reaksi masing – masing untuk tabung sam- pel, kontrol, dan blanko. Pada penentuan pH optimum digunakan buffer fosfat 0,1 M dengan variasi pH 7; 8; dan 9. Prosedur kerja dilakukan sama seperti Lampiran 4, tetapi pada tabung sampel dan tabung kontrol digunakan substrat kasein 1 dengan variasi pH 7; 8; dan 9.

b. Penentuan Suhu Optimum

Menyiapkan beberapa tabung reaksi masing – masing untuk tabung sampel, kontrol dan blanko. Prosedur kerja dilakukan sama seperti Lampiran 4. Penentuan suhu optimum dilakukan pada berbagai suhu inkubasi, yaitu 31°C; 33°C; 35°C; 37°C; dan 39°C. Waktu inkubasi yang digunakan selama 20 menit dan pH optimum yang diperoleh dari prosedur sebelumnya. 27

c. Penentuan Waktu Inkubasi Optimum

Menentukan waktu inkubasi optimum dilakukan dengan menentukan aktivitas enzim pada berbagai waktu inkubasi, yaitu 10 menit; 15 menit; 20 menit; 25 menit; dan 30 menit. Penentuan ini dilakukan pada pH dan suhu optimum dari prosedur sebelumnya. Prosedur yang dilakukan sama seperti Lampiran 4 dengan menggunakan variasi waktu inkubasi.

d. Penentuan Konsentrasi Substrat Maksimum

Menentukan konsentrasi substrat yang sesuai dengan enzim tripsin dilakukan dengan variasi konsentrasi 2 mgmL; 4 mgmL; 6 mgmL; 8 mgmL dan 10 mgmL. Penentuan ini dilakukan pada pH, suhu, dan waktu inkubasi optimum. Prosedur yang dilakukan sama seperti lampiran 4 dengan menggunakan variasi konsentrasi substrat.

e. Penentuan Aktivitas Enzim Tripsin Pada Kondisi Optimum

Prosedur yang dilakukan dalam menentukan aktivitas enzim tripsin pada kondisi optimum yaitu sama dengan Lampiran 4. Penentuan ini dilakukan pada pH, suhu, dan waktu inkubasi optimum yang telah diketahui pada prosedur sebelumnya.

f. Penentuan Aktivitas Enzim Tripsin terhadap Penambahan ZnSO

4 dengan Metode Anson Termodifikasi 1 Tabung Ts sampel Memasukkan 5 mL larutan kasein 1 ke dalam 5 tabung reaksi yang berbeda kemudian melakukan prainkubasi selama 5 menit pada suhu 37 o C. Kemudian menambahkan secara bervariasi konsentrasi ZnSO 4 0,0010 M; 28 0,0015 M; 0,0020 M; 0,0025 M; dan 0,0030 M pada masing-masing tabung sebanyak 1 mL dan 1 mL larutan tripsin serta diaduk hingga homogen. Setelah itu, melakukan inkubasi selama waktu inkubasi optimum dan pada suhu optimum yang telah diperoleh pada prosedur sebelumnya. Setelah diinkubasi tambahkan 3 mL larutan TCA 10 dan mengaduknya dengan kuat untuk menghentikan reaksi. Mendiamkan 20 menit dalam air es. Semua tabung disentrifugasi klinis selama 15 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Mengambil 2 mL filtrat yang telah disentrifugasi. 2 Tabung B Blangko Memasukkan 2 mL buffer fosfat 0,1 M ke dalam tabung reaksi. 3 Tabung T o Kontrol Memasukkan 1 mL larutan tripsin kedalam 5 tabung reaksi berbeda. Kemudian memasukan 3,0 mL TCA 10 dan diaduk sampai homogen. Selanjutnya, menambahkan secara bervariasi ZnSO 4 pada masing-masing tabung sebanyak 1 mL dan memasukkan 5 mL larutan kasein 1 yang telah dilakukan prainkubasi selama 5 menit pada suhu 37 o C ke dalam 5 tabung reaksi yang berbeda serta mengaduknya dengan kuat. Selanjutnya, didiam- kan 20 menit dalam air es. Semua tabung disentrifugasi klinis selama 15 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Kemudian, diambil 2 mL filtrat yang telah disentrifugasi. Filtrat diuji dengan metoda Anson yaitu dengan mencampurkan 2 mL TCA-filtrat dengan 4 mL 0,5 M NaOH. Lalu, ditambahkan 1 mL reagen Folin- Ciocalteau dan mendiamkan selama 10 menit kemudian mengukur absorbansinya pada panjang gelombang 650 nm. Untuk blanko langsung dilakukan penambahan 29 4 mL 0,5 M NaOH dan 1 mL reagen Folin-Ciocalteau. Ringkasan cara kerja dapat dilihat dalam bentuk bagan pada Lampiran 5.

E. Teknik Analisa Data