19
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Pharmacy Sterile Technology PST, Laboratorium Pharmacy Solid Preparation PSO, Laboratorium
Pharmacy Natural Product Chemistry PNA, Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Biologi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta. Penelitian berlangsung selama bulan April-Mei 2013.
3.2 Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan adalah sebagai berikut:
3.2.1 Alat
Cawan petri, batang spreader, labu ukur, erlemeyer 1000 ml, spuit, gelas piala 250 ml, tabung reaksi pyrex, kaca objek, jarum ose, batang pengaduk,
spatula, mikropipet, alumunium foil, vortex, neraca analitik, oven Memmert, autoklaf, termometer, termohigrometer, inkubator France EtuversC3000,
refrigerator Sanyo Medicool, api bunsen, Laminar air flow Clean Beach, Mikroskop Olympus CX21.
3.2.2 Bahan S
ampel dari 3 macam produk probiotik yang berisi strain tunggal bakteri probiotik yaitu sampel X yang berisi Lactobacillus acidophilus 3 x 10
8
cfug, sampel Y yang berisi Lactobacillus reuteri 1x 10
8
cfug dan sampel Z yang berisi Lactobacillus sporogenes 5 x 10
7
cfug, medium MRSA Oxoid, NaCl fisiologis 0,9, kristal violet, lugol, alkohol 96, dan safranin.
3.3 Prosedur Kerja
Prosedur kerja yang akan dilakukan adalah sebagai berikut :
3.3.1 Preparasi Alat dan Bahan yang Digunakan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.1.1 Preparasi Alat
Peralatan gelas seperti cawan petri, batang spreader, batang pengaduk, spatula, erlemeyer 500 ml, gelas piala 250 ml dibungkus dengan kertas roti dan
kemudian disterilkan dengan menggunakan oven pada suhu 180
○
C selama 120 menit Collin, et al., 2004.
3.3.1.2 Preparasi Sampel
Tiga produk sampel X, Y dan Z disimpan dalam kemasan asli pada tiga kondisi suhu 4
○
C di lemari pendingin , 25
○
C di ruangan yang diatur suhunya dan 44
○
C di oven selama 4 minggu dengan interval pengujian viabilitas 0, 1, 2, 3, dan 4 minggu.
3.3.1.3 Pembuatan Medium MRSA DeMan Rogosa Sharpe
Sejumlah 62 gram serbuk MRS ditimbang dan kemudian dilarutan dalam 1 liter air destilasi dan dipanaskan pada suhu 60
○
C. Lalu media disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 115
○
C, tekanan 1 atm selama 30 menit. Setelah dikeluarkan dari autoklaf, media didiamkan beberapa saat hingga suhunya
menurun sampai sekitar 45
○
C kemudian media dituangkan ke dalam cawan petri steril yang dilakukan di dalam Laminar Air Flow Bridson, 1998.
3.3.2 Identifikasi Bakteri pada Sampel X, Y dan Z dengan Pewarnaan Gram
Ketiga sampel disuspensikan dalam NaCl fisiologis 0,9 dan dibuat konsentrasi 10
-1
. Kemudian disebar pada medium MRSA dan diinkubasi selama 24 jam. Isolat bakteri yang terbentuk dari masing-masing sampel diletakkan
pada kaca objek dan dibuat film tipis lalu dibiarkan kering Collins, et al., 2004. Permukaan preparat diberi tetesan kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit
lalu dibilas dengan air mengalir. Preparat diberi tetesan lugol dan dibiarkan selama 1 menit lalu dibilas dengan air mengalir. Kemudian preparat dicuci
dengan alkohol 96 sampai kristal violet pada preparat tidak luntur lagi lalu dibilas dengan air mengalir. Selanjutnya preparat diberi tetesan zat warna
safranin dan dibiarkan selama 45 detik lalu dibilas dengan air mengalir. Preparat
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dikeringkan dengan membiarkan didekat nyala api atau menekan-nekan preparat secara perlahan-lahan dengan tissue. Selanjutnya preparat diamati di bawah
mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000x.
3.3.2 Pengujian Viabilitas Bakteri pada Sampel X, Y dan Z
Viabilitas bakteri diamati berdasarkan metode Standart Plate Count S. Mulyani, et al., 2008. Sampel dari masing-masing suhu penyimpanan
disuspensikan dalam NaCl Fisiologis 0,9 secara aseptis dan dibuat konsentrasi 10
-1
. Untuk sampel X yakni sebanyak 1 gram di cukupkan sampai 10 ml NaCl fisiologis Kemudian dibuat pengenceran sampai 10
-10
, untuk sampel Y yakni sebanyak 0,5 gram sampel dicukupkan sampai 5 ml NaCl fisiologis dan dibuat
pengenceran sampai 10
-8
, 10
-7
untuk sampel Z. Dari masing-masing pengenceran diambil 1 ml untuk sampel X dan 0,5 ml untuk sampel Y dan Z kemudian di
masukkan ke cawan petri, dan dilakukan dengan tiga kali pengulangan. Kemudian disebar ke MRS agar. Sampel diratakan di permukaan agar menggunakan
spreader. Dibiarkan hingga cairan dalam cawan petri membeku, semua cawan petri dimasukkan dengan posisi terbalik ke dalam inkubator dan diinkubasi pada
suhu 37
○
C ± 1
○
C selama 24 jam. Pertumbuhan bakteri koloni dicatat, pada setiap cawan petri yang mengandung 30-300 koloni. Kemudian dilakukan perhitungan
jumlah total koloni dengan rumus Depson, 2012. :
Kemudian jumlah bakteri setelah perlakuan dibandingkan dengan komposisi jumlah bakteri pada produk sampel yang tercantum dalam kemasan.
3.4 Analisa Data
Data jumlah total Koloni dari masing-masing sampel dianalisis secara statistik dengan menggunakan perangkat lunak SPSS 20.0 for windows dengan
metode One Way Repeated Measures Anova untuk mengetahui perbandingan dari penggunaan ketiga suhu penyimpanan.
Cfugram = total koloni
x
1 �����������
x
1 ��� � ��
22
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pemilihan dan Preparasi Sampel
Pada dasarnya probiotik merupakan makhluk hidup, di mana daya tahan hidupnya dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Salah satu faktor tersebut adalah
suhu penyimpanan. Berdasarkan laporan menyebutkan bahwa suhu seringkali menjadi aspek yang terlupakan oleh konsumen dalam menyimpan produk
probiotik dan beberapa laporan mengatakan bahwa dalam beberapa produk komersial, tingkat probiotik yang layak tidak memenuhi kriteria peraturan pada
akhir penyimpanan Mallago, et al., 2011. Oleh karena itu, dilakukan penelitian terhadap 3 produk probiotik yang beredar di Apotek yang berada di wilayah
Ciputat. Produk probiotik yang dipilih adalah sampel X yang berisi Lactobacillus achidophilus dengan jumlah bakteri 3,0 x 10
10
cfu dalam bentuk granul, sampel Y berisi Lactobacillus reuteri dengan jumlah bakteri 1 x 10
8
cfu dalam bentuk tablet kunyah dan sampel Z yang berisi Lactobacillus sporogenes dengan jumlah
bakteri 5 x 10
7
cfu dalam bentuk tablet. Penelitian terhadap ketiga sampel dilakukan pada tiga suhu yang berbeda
yaitu pada suhu 4
○
C, 25
○
C dan 44
○
C. Suhu 4
○
C merupakan suhu penyimpanan ideal probiotik pada lemari pendingin, suhu 25
○
C dikondisikan sebagai suhu ruangan, dan suhu 44
○
C diadaptasi dengan kondisi iklim terpanas yang pernah terjadi di Indonesia yakni di Bojonegoro pada tahun 2010.
Medium yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri yaitu MRSA dengan komposisi pepton, lab-lemco powder, yeast extract, glukosa, sorbitan
mono-oleat, dipotassium hidrogen posfat, sodium asetat 3H
2
O, triamonium sitrat, magnesium sulfat 7H
2
O, mangan sulfat 4H
2
O. MRS Agar merupakan medium selektif yang digunakan untuk menumbuhkan Lactobacillus De vos, et al., 2009.
Metode yang digunakan untuk menghitung viabilitas atau ketahanan hidup bakteri pada penelitian ini adalah metode Standart Plate Count dengan prinsip
apabila sel bakteri yang masih hidup ditumbuhkan pada medium yang cocok