Jenis dan Rancangan Penelitian Tata Cara Analisis Hasil

19

BAB III METODELOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel utama

a. Variabel bebas Variabel bebas penelitian ini adalah variasi dosis dalam pemberian jangka panjang infusa herba Bidens pilosa L. b. Variabel tergantung Variabel tergantung penelitian ini adalah penurunan aktivitas ALT - AST serum akibat pemberian jangka panjang infusa herba Bidens pilosa L. pada tikus betina galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida.

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali Variabel pengacau terkendali penelitian ini adalah kondisi hewan uji, yaitu tikus betina galur Wistar dengan berat badan 130-200 g dan umur 2-3 bulan, frekuensi pemberian infusa herba Bidens pilosa L. satu kali sehari selama enam hari berturut-turut dengan waktu pemberian yang sama, dan rute pemberian secara per oral p.o. Herba Bidens pilosa L. diperoleh dari Sleman, Daerah Istimewa Yogyakarta. b. Variabel pengacau tak terkendali Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah kondisi patologis dan fisiologis tikus betina galur Wistar yang digunakan sebagai hewan uji.

3. Definisi operasional

a. Herba Bidens pilosa L. Herba Bidens pilosa L. adalah semua bagian tumbuhan di atas tanah batang, daun, bunga, dan biji Bidens pilosa L. b. Infusa herba Bidens pilosa L. Infusa serbuk kering herba Bidens pilosa L. 16 didapatkan dengan cara menginfudasi 8,0 g serbuk kering herba Bidens pilosa L. dalam 50,0 ml air pada suhu 90°C selama 15 menit. c. Dosis efektif Dosis yang memberikan efek hepatoprotektif paling besar dengan penurunan aktivitas ALT dan AST serum yang berbeda bermakna jika dibandingkan dengan variasi dosis lainnya. d. Efek hepatoprotektif Efek hepatoprotekif adalah kemampuan infusa herba Bidens pilosa L. pada dosis tertentu untuk melindungi hepar dari hepatotoksin dengan menurunkan aktivitas ALT dan AST serum yang secara statistik berbeda bermakna dengan kontrol hepatoksin karbon tetraklorida. e. Jangka panjang Jangka panjang adalah pemberian infusa herba Bidens pilosa L. satu kali sehari selama enam hari berturut-turut.

C. Bahan Penelitian

1. Bahan utama

a. Hewan uji yang digunakan adalah tikus betina galur Wistar dengan umur 2-3 bulan dengan berat badan 130-200 g yang diperoleh dari Laboratorium Hayati Imono Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. b. Bahan uji yang digunakan adalah herba Bidens pilosa L. yang diperoleh dari Dusun Jenengan, Desa Maguwoharjo, Kecamatan Depok, Sleman, Daerah Istimewa Yogyakarta. 2. Bahan kimia a. Bahan hepatotoksin yang digunakan adalah karbon tetraklorida Merck ® . b. Kontrol negatif yang digunakan adalah olive oil yang diperoleh dari PT. Brataco. c. Pelarut untuk infusa digunakan aquadest yang diperoleh dari Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. d. Pelarut hepatotoksin digunakan olive oil yang diperoleh dari PT. Brataco. e. Blanko pengukuran aktivitas ALT-AST serum menggunakan aqua bidestilata yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis dan Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. f. Reagen serum ALT-AST dari DiaSys ®.

D. Alat penelitian

1. Alat pembuatan serbuk kering herba Bidens pilosa L

. Alat-alat yang digunakan antara lain oven, mesin penyerbuk, dan ayakan.

2. Alat pembuatan infusa herba Bidens pilosa L.

Panci lapis alumunium, stopwatch, thermometer, beaker glass, gelas ukur, labu takar, corong, cawan porselen, batang pengaduk, penangas air, timbangan analitik, dan kain flanel.

3. Alat uji penetapan kadar air

Moisture balance, beaker glass, dan sendok.

4. Alat uji hepatoprotektif

Seperangkat alat gelas berupa beaker glass, gelas ukur, tabung reaksi, labu ukur, pipet tetes, batang pengaduk Pyrex Iwaki Glass®, timbangan analitik Mettler Toledo®, sentrifuge Centurion Scientific®, vortex Genie Wilten®, spuit injeksi p.o. dan i.p., pipa kapiler, tabung Eppendorf, Microlab 200 Merck®, stopwatch, dan blue tip.

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman Herba Bidens pilosa L

Determinasi dilakukan dengan mencocokkan ciri-ciri tanaman herba Bidens pilosa L. dengan buku acuan karangan Backer tahun 1963. Determinasi dilakukan oleh Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., dosen Jurusan Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Pengumpulan bahan uji

Bahan uji yang digunakan adalah herba Bidens pilosa L. yang meliputi semua bagian tumbuhan di atas tanah batang, daun, bunga, dan biji, dipilih yang masih bagus dan terhindar dari penyakit. Bahan uji diperoleh dari Dusun Jenengan, Sleman, DIY pada bulan Juli 2014.

3. Pembuatan serbuk herba Bidens pilosa L.

Herba Bidens pilosa L. dicuci bersih, dipotong-potong, dan dikering- anginkan. Setelah itu, untuk mengoptimalkan pengeringan dilakukan pengeringan dengan menggunakan oven pada suhu 50 C selama 24 jam. Setelah benar-benar kering, herba diserbuk dan diayak dengan ayakan nomor 40.

4. Penetapan kadar air pada serbuk herba Bidens pilosa L.

Serbuk kering herba Bidens pilosa L. yang sudah diayak dimasukkan ke dalam alat moisture balance sebanyak 5 g kemudian diratakan. Bobot serbuk kering herba tersebut ditetapkan sebagai bobot sebelum pemanasan bobot A, setelah itu dipanaskan pada suhu 105 C. Serbuk kering herba Bidens pilosa L. yang sudah dipanaskan ditimbang kembali dan dihitung sebagai bobot setelah pemanasan bobot B. Kemudian dilakukan perhitungan terhadap selisih bobot A terhadap bobot B yang merupakan kadar air serbuk herba Bidens pilosa L.

5. Pembuatan infusa herba Bidens pilosa L.

Untuk membuat infusa herba Bidens pilosa L. dengan konsentrasi 16, serbuk kering herba Bidens pilosa L. diambil sejumlah 8,0 g, dibasahkan dengan 16,0 mL aquades kemudian ditambah dengan 50 mL aquadest. Campuran ini kemudian dipanaskan di atas heater pada suhu 90°C selama 15 menit, dihitung ketika suhu pada campuran mencapai 90°C. Jika air yang diperoleh kurang, maka air dapat ditambahkan selagi panas melalui ampas rebusan hingga volume mencapai 50,0 mL.

6. Pembuatan larutan karbon tetraklorida konsentrasi 50

Larutan karbon tetraklorida dibuat dalam konsentrasi 50 dengan mencampur larutan karbon tetraklorida dan olive oil dengan perbandingan volume 1:1.

7. Uji pendahuluan

a. Penetapan dosis infusa herba Bidens pilosa L. Pada penelitian ini digunakan 3 peringkat dosis yaitu rendah dosis I, tengah dosis II, dan tinggi dosis III. Dosis III ditetapkan dengan cara sebagai berikut : D x BB = C x V Keterangan : D = Dosis III BB = Berat badan tikus tertinggi C = Konsentrasi tertinggi infusa herba Bidens pilosa L. yang bisa dibuat V = ½ Vmax D x 200g = 16 x 0,25 mL D x 0,2 kg = 0,16 gmL x 2,5 mL D = 2,0 gkgBB Peringkat dosis dibuat dengan faktor kelipatan dua sehingga didapat dosis I sebesar 0,5 gkgBB ; dosis II sebesar 1,0 gkgBB dan dosis III sebesar 2,0gkgBB. b. Penetapan dosis hepatotoksik karbon tetraklorida Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Priya, Swati, dan Vilasrao 2013, bila karbon tetraklorida dengan dosis 2,0 mLkg diberikan secara intraperitonial pada tikus betina, maka dapat menyebabkan kerusakan organ hati yang ditandai dengan peningkatan serum ALT-AST tanpa menyebabkan kematian. Sehingga pada penelitian ini digunakan dosis 2,0 mLkgBB. c. Penetapan waktu pencuplikan darah Penetapan waktu pencuplikan darah ditentukan melalui orientasi dengan 5 ekor tikus. Setiap ekor tikus diambil darahnya melalui sinus orbitalis mata menggunakan pipa kapiler pada jam ke-0, 24, dan 48 setelah pemberian karbon tetraklorida. Kemudian diukur aktivitas serum ALT-AST.

8. Pengelompokkan dan perlakuan hewan uji

Sejumlah empat puluh dua ekor tikus dibagi secara acak ke dalam enam kelompok perlakuan masing-masing sejumlah lima ekor tikus. a. Kelompok I kontrol hepatotoksin diberi larutan karbon tetraklorida dengan dosis 2,0 mLkg BB secara intraperitonial. Pengambilan darah dilakukan setelah 24 jam. b. Kelompok II kontrol negatif diberi olive oil 2,0 mLkgBB secara intraperitonial. Pengambilan darah dilakukan setelah 24 jam. c. Kelompok III kontrol infusa diberi infusa herba Bidens pilosa L. dosis tinggi selama enam hari berturut-turut secara p.o. Pengambilan darah dilakukan pada hari ke tujuh. d. Kelompok IV dosis I diberi infusa herba Bidens pilosa L. dosis 0,5 gkgBB secara p.o sekali sehari selama enam hari berturut-turut. e. Kelompok V dosis II diberi infusa herba Bidens pilosa L. dosis 1,0 gkgBB secara p.o sekali sehari selama enam hari berturut-turut. f. Kelompok VI dosis III diberi infusa herba Bidens pilosa L. dosis 2,0 gkgBB secara p.o sekali sehari selama enam hari berturut-turut. Pada hari ke tujuh kelompok IV, V, dan VI diberi karbon tetraklorida dengan dosis 2,0 mLkg BB secara intraperitonial. Setelah 24 jam, diambil darahnya melalui sinus orbitalis mata, lalu diukur aktivitas serum ALT-AST.

9. Pembuatan serum

Pembuatan serum dilakukan dengan mengambil darah tikus melalui bagian sinus orbitalis mata, kemudian didiamkan selama 15 menit. Sentrifuge dengan kecepatan 8000 rpm selama 15 menit setelah terpisah, bagian supernatan diambil, kemudian di sentrifuge kembali dengan kecepatan 8000 rpm selama 15 menit.

10. Pengukuran aktivitas serum ALT-AST

Pengukuran aktivitas serum ALT-AST dilakukan menggunakan alat Microlab 200 Merck di Labolatorium Fakultas Farmasi Sanata Dharma, Yogyakarta. Pengukuran aktivitas Serum ALT dilakukan dengan cara mencampurkan 100 mL serum dengan 1000 mL reagen I ditunggu selama 2 menit kemudian ditambahkan 250 mL reagen II, dan ditunggu selama 1 menit sebelum diukur menggunakan Mircrolab. Pengukuran aktivitas serum AST juga dilakukan dengan hal yang sama, namun digunakan reagen untuk pengukuran aktivitas AST.

F. Tata Cara Analisis Hasil

Data aktivitas serum ALT-AST diuji dengan Saphiro-Wilk untuk mengetahui distribusi data tiap kelompok hewan uji. Apabila didapat distribusi data yang normal maka analisis dilanjutkan dengan analisis pola searah One Way ANOVA dengan taraf kepercayaan 95 untuk mengetahui perbedaan masing- masing kelompok. Kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe untuk melihat perbedaan masing-masing antar kelompok bermakna signifikan p0,05 atau tidak bermakna tidak signifikan p0,05. Namun, bila didapatkan distribusi tidak normal, maka dilakukan analisis dengan uji Kruskal Wallis untuk mengetahui perbedaan aktivitas serum ALT-AST antar kelompok. Setelah itu, dilanjutkkan dengan uji Mann Whitney untuk mengetahui perbedaan tiap kelompok. Perhitungan persen efek hepatoprotektif terhadap hepatotoksin karbon tetraklorida diperoleh dengan rumus: 1 − purata ALT perlakuan − purata ALT kontrol negatif purata ALT kontrol hepatoksin − purata ALT kontrol negatif × 100 1 − purata AST perlakuan − purata AST kontrol negatif purata AST kontrol hepatoksin − purata AST kontrol negatif × 100

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efek anti hepatoprotektif dari infusa herba Bidens pilosa L. terhadap tikus putih betina terinduksi karbon tetraklorida CCl 4 berdasarkan aktivitas enzim ALT dan AST dalam darah.

A. Hasil Determinasi Tanaman

Pada penelitian hepatoprotektif ini digunakan herba Bidens pilosa L. sebagai bahan yang akan diuji aktivitasnya. Determinasi bertujuan untuk memastikan bahan yang digunakan adalah herba Bidens pilosa L., sehingga tidak terjadi kesalahan dalam penyiapan bahan. Determinasi dilakukan oleh bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si. di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta dengan menggunakan buku acuan karangan Backer1963. Bagian tanaman yang dideterminasi adalah batang, daun, bunga, dan biji. Proses determinasi dilakukan hingga tingkat spesies. Hasil determinasi membuktikan bahwa bahan yang digunakan benar dari tanaman Bidens pilosa L. B. Penyiapan Bahan 1. Pembuatan serbuk herba Bidens pilosa L. Herba Bidens pilosa L. dibuat serbuk agar memperbesar luas kontak herba dengan pelarut, sehingga senyawa fitokimia yang terdapat pada herba Bidens pilosa L. lebih mudah larut.