Bahan penelitian Instrumen penelitian Tata Cara Penelitian

28

C. Bahan penelitian

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi: 1. daun pandan wangi yang diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat Tawangmangu. 2. batu ginjal yang diperoleh dari Laboratorium Patologi Klinik Fakultas Kedokteran UGM. 3. kalsium karbonat Merck, etil asetat Merck, petroleum eter GT Baker, etanol p.a Merck, n-butanol Merck, asam asetat Merck, asam klorida Merck. 4. tween 80, aquadest, larutan amonium karbonat, larutan asam sulfat encer, larutan amonium oksalat, larutan kalium kromat, larutan kalium ferosianida dari Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi USD .

D. Instrumen penelitian

Instrumen atau alat yang dipakai dalam penelitian ini antara lain : spektrofotometer serapan atom Instrumentation Laboratory aaae Spectrophotometer 451, mortir dan stamper, ayakan ukuran 1218 dan 2050 mesh Retsch, Soxhlet Quickfit , corong Buchner, rotaevaporator Janke Kunkel IKA-Labortechnik RV 05-ST, alat-alat gelas Pyrex, penangas air Memmert, termometer Filled, dan bejana KLT. 29

E. Tata Cara Penelitian

1. Tanaman pandan wangi segar tanpa bunga dan buah dideterminasi di Balai Penelitian Tanaman Obat Tawangmangu. 2. Pengumpulan bahan Pengumpulan daun pandan wangi dilakukan pada bulan Agustus 2006. Batu ginjal diperoleh dari Laboratorium Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada Yogyakarta. 3. Penyiapan bahan a. Pembuatan serbuk daun pandan wangi Daun pandan wangi yang digunakan dalam penelitian ini sudah berada dalam bentuk serbuk. Pembuatan serbuk daun pandan wangi dilakukan oleh Balai Penelitian Tanaman Obat Tawangmangu. Serbuk daun pandan wangi tersebut diayak sehingga diperoleh derajat halus serbuk daun 1218. b. Pembuatan serbuk batu ginjal Batu ginjal digerus dengan mortir dan stamper lalu diayak dengan ayakan 2050 mesh. 4. Pembuatan fraksi air dan etil asetat daun pandan wangi a. Penghilangan lemak serbuk daun Serbuk daun pandan wangi ditimbang 30,0 gram, dibungkus dengan kertas saring sedemikian rupa sehingga dapat dimasukkan dalam Soxhlet tanpa ada bagian yang bocor. Ekstraksi dengan 150 ml petroleum eter, volume 2 kali sirkulasi, dengan pemanasan pada suhu 40 – 60 o C hingga pelarut tidak berwarna. Setelah itu serbuk dikeringkan kembali. 30 b. Penyarian flavonoid Serbuk yang telah dihilangkan lemaknya kemudian dimaserasi dengan 225 ml etanol 70 selama 5 x 24 jam hingga pelarut jernih. Selanjutnya disaring dengan corong Buchner sehingga didapatkan filtrat. Filtrat dipekatkan dengan rotaevaporator sampai sebagian besar etanolnya menguap dan diperoleh ekstrak kental bebas etanol. c. Fraksinasi flavonoid Ekstrak kental bebas etanol yang diperoleh dari hasil penyarian flavonoid, diekstraksi dengan 25 ml etil asetat beberapa kali sampai lapisan etil asetatnya tidak berwarna. Lalu sari etil asetat dipekatkan hingga tidak berbau. Setelah itu sari etil asetat dipipet 10,0 ml kemudian ditambah 1,0 ml tween 80 dan diencerkan dengan aquadest hingga 100 ml. Dengan demikian diperoleh fraksi etil asetat dengan konsentrasi 10 v v . Ekstrak kental bebas etanol sisa yang telah dipekatkan, dipipet 10,0 ml kemudian ditambah dengan 1,0 ml tween 80 dan diencerkan dengan aquadest sampai 100 ml sehingga diperoleh fraksi air dengan konsentrasi yang sama dengan fraksi etil asetat yaitu 10 v v . 5. Kromatografi Lapis Tipis Dari fraksi air dan fraksi etil asetat daun pandan wangi 10 v v , masing- masing dipipet 10,0 ml, diuapkan di atas waterbath hingga tersisa 5 ml. Selanjutnya kedua fraksi ditotolkan pada lempeng selulosa, dielusi dengan fase gerak n-butanol : asam asetat : air 4 : 1 : 5 v v , dipakai fase atas, dengan panjang elusi 10 cm, sebagai pembanding digunakan rutin 0,05 b v . Deteksi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 31 bercak dengan sinar UV 365 nm, uap amonia, pereaksi semprot AlCl 3 dan sitroborat. 6. Analisis kualitatif batu ginjal Serbuk batu ginjal dengan derajat halus 2050 mesh ditambah dengan aquadest, diasamkan dengan HCl 0,1 M dan disaring. Filtrat yang didapat digunakan untuk uji individual kation kalsium Ca 2+ dan juga diukur menggunakan spektrofotometer serapan atom. Reagensia yang digunakan untuk uji individual kation kalsium Ca 2+ yaitu larutan amonium karbonat, asam sulfat encer, amonium oksalat, kalium kromat, dan kalium ferosianida Vogel, 1979. 7. Pengelompokan subjek uji dan perlakuannya Subjek uji batu ginjal dibagi menjadi sembilan kelompok perlakuan, yaitu: I. Kontrol negatif aquadest ditambahkan 1,0 ml tween 80 kemudian diencerkan sampai 100 ml. II. Fraksi air daun pandan wangi 2,5 v v III. Fraksi air daun pandan wangi 5 v v IV. Fraksi air daun pandan wangi 7,5 v v V. Fraksi air daun pandan wangi 10 v v VI. Fraksi etil asetat daun pandan wangi 2,5 v v VII. Fraksi etil asetat daun pandan wangi 5 v v VIII. Fraksi etil asetat daun pandan wangi 7,5 v v IX. Fraksi etil asetat daun pandan wangi 10 v v Pembuatan fraksi air dan fraksi etil asetat daun pandan wangi 2,5 v v , 5 v v , 7,5 v v , 10 v v dilakukan dengan mengambil 2,5 ml ; 5 ml ; 7,5 ml ; dan 10 ml fraksi air dan fraksi etil asetat daun pandan wangi 10 v v hasil fraksinasi flavonoid kemudian diencerkan dengan aquadest hingga 10 ml. 32 8. Perendaman batu ginjal dalam kelompok perlakuan Subjek uji batu ginjal direndam pada sembilan kelompok perlakuan. Sebanyak 100,0 mg serbuk batu ginjal dimasukan ke dalam tabung reaksi bertutup. Tabung reaksi diletakkan di atas penangas air pada suhu 37 o C selama 6 jam dan digojog setiap 30 menit selama 1 menit. Setelah 6 jam, hasil perendaman disaring dengan kertas saring dan diperoleh filtrat yang digunakan untuk pengukuran kadar kalsium terlarut dengan spektrofotometer serapan atom. 9. Preparasi alat Untuk penetapan kadar kalsium, digunakan spektrofotometer serapan atom dengan kondisi alat sebagai berikut: Sumber Cahaya : Hollow Cathode Lamp Arus lampu : 7-15mA λ : 422,7 nm Oksidan : udara 11,4 litermenit Bahan bakar : asetilena 1,3 litermenit Setelah kondisi alat sesuai, dilakukan pembacaan serapan baku dan sampel. 10. Analisis kadar kalsium batu ginjal yang larut dalam fraksi air dan etil asetat dengan spektrofotometer serapan atom a. Pembuatan kurva baku kalsium Pembuatan kurva baku diawali dengan membuat larutan stok kalsium 1000 ppm. Larutan stok kalsium dibuat dengan melarutkan 249,7 mg CaCO 3 dalam 50 ml HCl 0,1M dan ditambah aquadest hingga 100 ml. Larutan standar dibuat dengan mengambil 0,6 ml ; 1,2 ml ; 1,8 ml ; 2,4 ml ; 3,0 ml larutan stok, diencerkan dengan aquadest sampai 100 ml sehingga diperoleh larutan baku kalsium dengan kadar 6 ppm, 12 ppm, 18 ppm, 24 33 pmm, 30 ppm. Pembacaan serapan larutan baku menggunakan spektrofotometer serapan atom. b. Pengukuran kadar kalsium batu ginjal yang larut dalam fraksi air dan fraksi etil asetat daun pandan wangi Filtrat hasil perendaman dari masing-masing kelompok perlakuan dipipet 1,0 ml kemudian ditambahkan aquadest hingga 10 ml sebagai larutan sampel. Pembacaan serapan larutan sampel menggunakan spektrofotometer serapan atom.

F. Tata cara analisis hasil