17
3. Fraksi etil asaetat adalah hasil fraksinasi ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea
Jack Danser yang telah diekstraksi cair-cair dengan air : washbensin 1:1 dan kemudian difraksinasi menggunakan etil asetat.
4. IC
50
adalah persen konsentrasi fraksi etil asetat yang mampu menghambat 50 aktivitas radikal bebas menggunakan spektrofotometer Uv-vis.
D. BahanPenelitian
1. Bahan Utama : Benalu S. ferruginea Jack Danser
dari T. aurea di lingkungan Universitas Sanata Dharma Kampus 3 Paingan, Maguoharjo, Sleman, Yogyakarta.
2. Bahan Kimia : Bahan kualitas p.a. E. Merck, yaitu metanol p.a ; bahan kualitas
p.a. Sigma Chem. Co., USA, yaitu Larutan DPPH 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil, reagen Folin-Ciocalteu, asam galat dan kuarsetin ; bahan kualitas teknis Brataco
Chemica di antaranya: etil asetat, etanol dan alumunium foil
E. Alat Penelitian
Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain adalah: neraca
analitik Scaltec SBC 22, BP 160p, vacum rotary evaporator Junke dan Kunkel, waterbath labo-tech, Heraeus, vortex Janke dan Kunkel, spektrofotometer UV-vis
Perkin Elmer Lamda 20, blender, corong Bucher, oven, mikropipet 10-1000µL; 1- 10 mL Acura 835, Socorex, tabung reaksi bertutup, alat-alat gelas yang lazim
digunakan di laboratorium analisis Pyrex-Germany dan Iwaki. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
F. Tata Pelaksanaan Penelitian 1.
Determinasi tanaman
Determinasi dilakukan adalah pada benalu S. ferruginea Jack Danser dari inang tanaman pohon bunga terompet Tabebuia aurea dilakukan di Laboratorium
Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta oleh Yohanes Dwiatmaka, M.Si.
determinasi dilakukan dengan cara membandingkan cirri dan sifat berdasarkan Flora of China.
2. Pengumpulan bahan
Benalu S. ferruginea Jack Danser dari tanaman T. aurea diperoleh dari Kampus III Universitas Sanata Dharma Paingan, Maguoharjo, Sleman, Yogyakarta.
Waktu panen tanaman benalu dilakukan pada musim penghujantanggal 9 bulan November 2014. Pemanenan yang dilakukan adalah memanen semua benalu S.
ferruginea Jack Danser yang tumbuh pada T. aurea.
3. Preparasi sampel
Bagian benalu S. ferruginea Jack Danser yang dikumpulkan yaitu daunnya. Selesai daun benalu tersebut dikumpulkan dilakukan pembersihan dengan pencucian
menggunakan air bersih mengalir. Selanjutnya dilakukan proses pengeringan pada sinar matahari dengan ditutupi kain hitam hingga benalu menjadi sangat kering agar
kadar air dalam daun tidak terlalu banyak karena jika kadar airnya banyak maka bisa
menggangu dalam kualitas penetapan kadar fenoliknya.
19
Setelah daun benalu tersebut dikeringkan kemudian dihancurkan menjadi serbuk menggunakan blender lalu diayak dan dipindahkan pada wadah tertutup yang
tidak mudah mengalami kelembaban. Serbuk dari sampel ditimbang 50 gram lalu dimasukkan dalam labu Erlenmeyer 500ml dilakukan menggunakan tiga labu
Erlenmeyer dengan masing-masing labu 50 gram serbuk daun benalu.
Labu Erlenmeyer yang terisi serbuk dimaserasi selama 3 hari menggunakan pelarut etanol 70 dengan bantuan shaker. Lalu maserat disaring menggunakan
kertas saring melalui corong buchner sehingga menghasilkan filtrat, kemudianampas dimaserasi kembali dengan etanol selama 1hari, hingga filtrat hampir tidak berwarna.
Semua filtrat disatukan dan dipekatkan dengan menggunakan vacuum rotatary evaporator sampai tidak ada lagi cairan yang menetes pada kondensor
sehingga diperoleh ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea Jack Danser. Ekstrak etanolik daun benalu S. ferruginea Jack Danser dipanaskan pada waterbath hingga
bobot tetap kemudian diekstraski cair-cair menggunakan air hangat + washbensin 1:1vv. Fase air diambil lalu diekstraksi cair-cair menggunakan etil asetat dengan
perbandingan fraksi air-etil asetat 1:1 vv. Lalu dipisahkan antara fraksi air dan etil- asetat. Fraksi etil-asetat pelarutnya diuapkan menggunakan vacuum rotatary
evaporator. Hasil fraksi tersebut ditampung dalam cawan porselen yang telah dihitung bobot tetap dan kemudian fraksinya dipanaskan hingga mendapat bobot
tetap lalu ditutup dengan alumunium foil lalu disimpan didalam desikator untuk digunakan pada analisis lebih lanjut.
20
4. Ujikandungan fenolik
a Pembuatan larutan baku asam galat Asam galat ditimbang sebanyak 10,0 mg dilarutkan dalam campuran 10 mL
akuades:metanol 1:1 sehingga diperoleh konsentrasi larutan asam galat 1000,0 µgmL. Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 mL larutan tersebut
laluditambahkan metanol p.a sampai batas sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100; 125; 150 µgmL.
b Pembuatan larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik Fraksi etil asetat ditimbang sebanyak 10,0 mg, lalu ditambahkan metanol p.a
sampai 10,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 1000,0 µgmL. Kemudian diambil 1,0 mL larutan tersebut dan ditambahkan 10,0 mL metanol p.a sehingga
diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 100 µgmL. c Uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolik
Sejumlah 0,5 mL larutan uji 100,0 µgmL dan larutan pembanding asam galat 150,0 µgmL masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditambah 2,5 mL
peraksi fenol Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan aquades 1:10 vv. Larutan didiamkan selama 10 menit, lalu ditambahkan 2 mL larutan natrium karbonat
1M, kemudian dihomogenkan dengan vortex selama 30 detik. Perubahan warna larutan menjadi biru menunjukkan keberadaan golongan senyawa fenolik.
21
d Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total 1. Penentuan Operating time
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; 150 µgmL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air 1:10 vv. Larutan
selanjutnyaditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Setelah itu absorbansinya dibaca menggunakan spetrofotometer Uv-vis pada panjang gelombang 750 nm setiap
selang waktu 5 menit selama 30 menit. Kemudian dilakukan juga untuk larutan uji setiap selang waktu 5 menit selama 60 menit menggunakan konsentrasi 100 µgmL
2.Penentuan panjang gelombang serapan maksimum Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; 150 µgmL ditambah dengan 5
mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air 1:10 vv. Larutan selanjutnyaditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Kemudian didiamkan
selama operating time, dibaca panjang gelombang pada serapan maksimum menggunakan spektrofotometri visibel dengan range panjang gelombang 600-800
nm. 3.
Pembuatan kurva baku asam galat Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; 150 µgmL
ditambahdengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air 1:10 vv. Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Setelah
OT, absorbansinya dibaca λ max terhadap blanko yang terdiri atas aquades;metanol
p.a 1:1, reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1M. Pengerjaannya dilakukakan 3 kali.
22
4. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Sebanyak 0,5 mL larutan uji 100µgmL, dimasukkan kedalam labu takar 10,0 mL dan dilanjutkan sebagaimana perlakuam pada pembuatan kurva baku asam galat.
Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai miligram ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat, dilakukan 3 kali replikasi.
5. Uji aktivitas antioksidan
1 Pembuatan larutan DPPH Sebanyak 15,8 mg DPPH dilarutkan dengan metanol p.a hingga 100,0 mL,
sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan aluminum foil dan harus selalu dibuta baru.
2 Pembuatan larutan stok kuersetin Kuersetin ditimbang sebanyak 10,0 mg dilarutkan dengan metanol p.a 10,0
mL hingga tanda batas. 3 Pembuatan larutan intermediet dan larutan baku pembanding kuersetin
Larutan stok kuersetin diambil sebanyak 1,0 ml kemudian diencerkan dengan metanol p.a hingga 10,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi larutan intermediet
standar kuersetin sebesar 100 µgmL. Kemudian larutan intermediet dengan konsentrasi 100 µgmL diambil 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 dan 1,5 mL larutan tersebut
ditambah metanol p.a 10,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku pembanding kuersetin sebesar 5,0; 7,5; 10,0; 12,5 dan 15,0 µgmL.
23
4 Pembuatan larutan uji untuk aktivitas antioksidan Fraksi etil asetat ditimbang sebanyak 10,0 mg dan ditambahkan 10 mL
metanol p.a sampai tanda batas sebagai stok larutan uji. Kemudian diambil 1,0 mL larutan stok larutan uji dan ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL sebagai larutan
intermdiet sehingga diperoleh konsentrasi 100,0 µgmL. Lalu diambil sebanyak 6; 6,25;
6,50; 6,75;
7,0 mL
larutan tersebut,
kemudian masing-masing
ditambahkanmetanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 60,0; 62,5; 65,0; 67,5; 70,0µgmL.
5 Uji pendahuluan aktivitas antioksidan Sebanyak 1 mL larutan DPPH masing-masing dimasukkan ke dalam tiga buah
tabung reaksi. Selanjutnya masing-masing ditambah 1 mL metanol, larutan pembanding kuerstin 37,5 µgmL, dan larutan uji 200 µgmL. Selajutnya larutan
ditambah dengan 3 mL metanol. Kemudian larutan dihomogenkan dengan vortex selama 30 detik. Perubahan warna larutan menjadi kekuningan menunjukkan adanya
aktivitas antioksidan. 6 Optimasi metode uji aktivitas antioksidan
a. Penetuan panjang gelombang Pada tiga labu ukur 10,0 mL, dimasukan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mL
larutan DPPH. Larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batassehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,20; 0,040; dan 0,060 mM. Larutan
tersebut kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik. Diamkan selama operating PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
time, lalu
dilakukan scaning
panjang gelombang
serapan maksimum
spektrofotometer Uv-visibel pada panjang gelombang 400-600 nm. b. Penentuan operating time
Sebanyak 2,0 mL larutan DPPH dimasukan kedalam masing-masing tiga labu ukur 10,0 mL, ditambahkan masing-masing dengan 2,0 mL larutan pembanding
kuersetin 5,0; 10,0; 15,0 µgmL. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas labu ukur 10,0 mL. Larutan tersebut kemudian
digojok dengan vortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spetrofotometer pada panjang gelombang 515 nm selama 1 jam.Kemudian dilakukan
juga untuk larutan uji 6,0 ; 65; 70µgmL. 7 Uji aktivitas antioksidan
1. Pengukuran absobansi larutan DPPH kontrol Pada labu ukur 10 mL, dimasukkan sebanyak 2 mL larutan DPPH dan larutan
tersebut ditambahkan dengan metanol hingga batas. Kemudian larutan dibaca absorbansinya pada saat OT 35 menit dan panjang gelombang serapan maskimum
yaitu 515 nm. Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali. 2. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan larutan uji
Sebanyak 2 ml larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing-masing labu ukur 10 mL yang sudah tersedia 5 labu ukur untuk larutan penbanding dan 5 labu ukur
untuk larutan uji dengan konsentrasi berbeda-beda. Kemudian ditambah dengan 2 mL larutan pembanding pada labu ukur untuk larutan pembanding dan 2 ml larutan uji
pada labu ukur untuk larutan uji. Selanjutnya campuran larutan tersebut masing- PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
masing ditambah dengan metanol hingga tanda batas. Masing-masing larutan tersebut kemudian dihomogenkan dengan vortex selama 30 detik dan didiamkan selama OT
30 menit. Larutan dibaca aborbansinya dengan spektrofotometer Uv-visibel pada panjang gelombang serapan maksimum hasil optimasi, yaitu 516 nm. Pengujian
dilakukan dengan 3 kali replikasi. 3. Estimasi aktivitas antioksidan
Data hasil pengukuran absorbansi larutan uji fraksi etil asetat S. ferruginea senyawa pembanding larutan rutin digunakan untuk menghitung nilai IC dan IC
50
. Aktivitas penagkapan radikal DPPH IC dihitung dengan rumus :
Nilai aktivitas antioksidan yang dinyatakan dengan IC
50
ditentukan dengan persamaan garis regresi linear antara konsentrasi larutan uji sumbu X dengan IC
sumbu Y. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
