Uji aktivitas antioksidan dan menggunakan metode radikal DPPH (1,1 Difenil 2-Pikrilhidrazil) dan penetapan kadar fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu scurrula ferruginea (Jack) danser pada tanaman tabebuia aurea (Manso) Benth. and H

INTISARI

Tumbuhan dalam dunia kesehatan dapat digunakan sebagai salah satu pendekatan terapi bahan alam yang ampuh untuk pengobatan berbagai penyakit.Pengobatan menggunakan tumbuhan Scurrula ferruginea (Jack) Danser dapat diterapkan untuk mengobati beberapa gangguan kesehatan pada tubuh manusia yang disebabkan oleh radikal bebas. Scurrula ferruginea (Jack) Danser tersebut mengandung kuersetin yang merupakan salah satu senyawa antioksidan.Penelitian ini bertujuan untukmengetahui aktivitas antioksidanmenggunakan metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidazil)berdasarkan nilai IC50dan jugamelakukan penetapan kadar fenolik total menggunakan metode reagen Folin-Ciocalteu yang dinyatakan dengan milligram (mg) ekuivalen asam galat per gram (g) fraksi. Penentuan aktivitas antioksidan dan penetapan kadar fenolik total tersebut menggunakan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser yang tumbuh pada tanaman (Tabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore).

Penentuan aktivitas antioksidan menggunakan spetrofotometer Uv-Vis pada panjang gelombang maksimum 515 nm dan penetapan kadar fenolik total dari fraksi etil asetat menggunakan spektrofotometer Uv-Vis pada panjang gelombang maksimum 739 nm.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S.ferruginea(Jack) Danser pada tanaman (Tabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore) memilik nilai IC50 sebesar(60,44 ± 2,16) µg/mL dan tergolong memiliki aktivitas antioksidan aktif atau kuat. Kemudian kadar fenolik total sebesar (49,87 ± 0,1838)mg ekuivalen asam galat per gram fraksi.

Kata kunci: Scurrula ferruginea (Jack) Danser, Tabebuia aurea Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore, DPPH, IC50, antioksidan, fenolik, spetrofotometri Uv-Vis, Folin-Ciocalte, ekstraksi dan fraksinasi.

ABSTRACT

The plants in the world of health can using as one therapeutic approach potent natural ingredients for the treatment of various diseases. Treatment using Scurrula ferruginea (Jack) Danser plants can be applied to treat some health problems in the human body caused by free radicals. Scurrula ferruginea (Jack) Danser contains quercetin which is one antioxidant compound.This study aims to determine antioxidant activity using DPPH (1,1-diphenyl-2-pikrilhidazil) method based on IC50 values and also determination of total phenolic content using the Folin-Ciocalteu reagent method to expressed by milligrams (mg) of gallic acid equivalents per gram (g) fraction.Determination of antioxidant activity and total phenolic assay using ethyl acetate fraction of ethanol extract of leaves mistletoes S. ferruginea (Jack) Danserthat grows on theTabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore.

The determination of antioxidant activity using spetrofotometer Uv-Vis at maximum wavelength 515 nm and the assay of the total phenolic fraction of ethyl acetate using Uv-Vis spectrophotometer at a wavelength of 739 nm maximum.

The results showed that the ethyl acetate fraction of ethanol extract of the leaves on the plant mistletoes S. ferruginea (Jack) Danser of Tabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore having an IC50 value of (60.44 ± 2.16) mg/mL and classified as having active or strong antioxidant activity. Then the total phenolic content was (49.87 ± 0.1838) mg gallic acid equivalents per gram fractions.

Keywords: Scurrula ferruginea (Jack) Danser, Tabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore, DPPH, IC50, antioxidants, phenolic, spetrofotometri Uv-Vis, Folin-Ciocalte, extraction and fractionation.

UJI AKITIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN METODE RADIKAL DPPH (1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL) DAN PENETAPAN KADAR FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL DAUN BENALU Scurrula ferruginea (Jack) Danser pada TANAMAN Tabebuia aurea

(Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Yonathan Pura Hama Nganggu NIM : 118114024 FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

UJI AKITIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN METODE RADIKAL DPPH (1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL) DAN PENETAPAN KADAR FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL DAUN BENALU Scurrula ferruginea (Jack) Danser pada TANAMAN Tabebuia aurea

(Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Yonathan Pura Hama Nganggu NIM : 118114024 FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

2016

HALAMAN PERSEMBAHAN

Kasih adalah sebuah kata sifat dan juga sebuah kata kerja…… Kasih adalah pengorbanan tanpa syarat………

Kasih adalah segenap hati, segenap jiwa, dan segenap kekuatan…

Kasih adalah bukan sebuah pengetahuan namun kenyataan……. Kasih adalah lebih banyak bertindak dari pada berkata-kata…….

Jika dunia hilang kasih maka dunia akan seperti kuburan…. Jika hidup tanpa kasih, maka kebahagianmu akan hilang….

Jika kasih itu hilang maka hancurlah dunia……….

Jika kasih itu hidup maka damai itu mulai timbul…………..

Kasih itu harus di pelihara agar semakin lama damai itu..

PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan karena berkat rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “UJI AKITIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN METODE RADIKAL DPPH (1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL) DAN PENETAPAN KADAR FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL DAUN BENALU Scurrula ferruginea (Jack) Danser pada TANAMAN Tabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore”sebagai salah satu syarat guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Dalam proses penelitian dan penyususnan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dukungan dari semua pihak sehingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Yohanes Dwiatmaka M.Si. sebagai Dosen Pembimbing yang telah memberikan bimbingan, pengarahan serta ilmu dalam penelitian dan penyususnan skripsi ini. 2. Prof. Dr. CJ. Soegihardjo sebagai Dosen Penguji atas pengarahan dan kesediaannya menguji skripsi.

3. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt sebagai Dosen Penguji atas pengarahan dan kesediaannya menguji skripsi.

4. Aris Widayati M.Si., Ph.D., Apt sebagai Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

5. Agustina Setiawati, M.Sc., Apt sebagai Dosen Pembimbing Akademik Farmasi Universitas Santa Dharma

6. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

7. Segenap laboran Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma khususnya laboratorium Farmakognosi-Fitokimia dan Biokimia.

8. Teman-teman Farmasi Angkatan 2011 dan khususnya FKK 2011, atas semangat, canda tawa, kebersamaan, dan perhatiannya.

9. Yonas Sinseng sebagai teman skripsi DPPH atas bantuan dan kejasamanya untuk menyelesaikan skripsi ini.

10. Semua pihak yang telah memberi dukungan dan bantuan yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini banyak kekurangan dan jauh sempurna, untuk itu dengan segala kerendahan hati penulis mengharapkan saran dan kritik guna perbaikan dan penyempurnaan skripsi ini. Harapan penulis semoga penelitian dan penyusunan skripsi ini bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang Farmasi

Yogyakarta, 20 November 2015

Penulis

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ……….. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING……….. ii

HALAMAN PENGESAHAN………. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN……….. iv

PRAKATA……….. v

PERYATAAN KEASLIHAN KARYA………. vii

LEMBAR PERYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA……. viii

DAFTAR ISI………... ix

DAFTAR TABEL ………. xii

DAFTAR GAMBAR……….. xiii

DAFTAR LAMPIRAN………... xiv

INTISARI……….... xv

ABSTRACT……….... xvi

BAB I PENGANTAR ……….... 1

A. Latar Belakang………... 1

B. Keaslian penelitian………... 3

C. Perumusan masalah……….... 4

D. Tujuan penelitian………... 4

E. Manfaat penelitian……….. 5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA………. 6

A. Benalu Scurrula ferruginea………... 6

B. Tebebuia aurea ( pohon bunga terompet )………... 8

C. Radikal bebas ………... 10

D. Antioksidan………... 11

E. Ekstrak………... 12

F. Etanol………. 12

G. Senyawa fenolik... ... 13

H. Metode DPPH………... 13

I. Metode spektrofotometri………... 14

J. Landasan teori………. 14

K. Hipotesis……… 15

BAB III METODE PENELITIAN……… 16

A. Jenis Rancangan Penelitian………... 16

B. Variabel... 16

C. Defenisi Operasional………... 16

D. Bahan Penelitian……… 17

E. Alat Penelitian……… 17

F. Tata Pelaksanaan Penelitian………... 18

1. Determinasi tanaman……….. 18

2. Pengumpulan bahan……….... 18

3. Preparasi sampel………. 18

4. Uji kandungan fenolik……….... 20

5. Uji aktivitas antioksidan………. 22

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN………... 26

A.Hasil Determinasi Tumbuhan……… 26

B.Hasil Pengumpulan Bahan………... 26

C. Hasil Preparasi………... 27

D.Hasil Ekstraksi………... 27

E. Hasil Fraksinasi Ekstrak……….. 29

F.Hasil Uji Pendahuluan………. 30

1.Uji pendahuluan aktivitas antioksidan………... 30

2.Uji keberadaan senyawa fenolik………... 32

G. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total………... 34

1. Penentuan operating time………... 34

2. Penentuan panjang gelombang maksimum……….. 36

H. Estimasi Kandungan Fenolik Total………. 36

I. Validasi Metode Analisis Penetapan Kandungan Fenolik Total…….... 38

1. Presisi………... 38

2. Linearitas……….. 39

J. Hasil Optimasi Metode Uji Antioksidan……….. 40

1. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( mak )…. 40

2. Penentuan operating time………. 41

K. Estimasi Akitivitas Antioksidan dengan Radikal Bebas DPPH……….. 43

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN………... 50

A. Kesimpulan ………... 50

B. Saran ………... 50

DAFTAR PUSTAKA ………... 51

LAMPIRAN………. 56

BIOGRAFI PENULIS……….. 81

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel I. Hasil scanning panjang gelombang maksimum asam galat

yang direaksikan dengan Folin-Ciocalteu…………... 36 Tabel II. Hasil penetuan jumlah kandungan fenolik total fraksi etil

asetat ekstrak etanolik daun benalu ………... 38 Tabel III. Nilai presisi seri kurva baku asam galat dalam penetapan

kandungan fenolik total……….. 39 Tabel IV. Hasil scanningpanjang gelombang serapan maksimum

pada berbagai konsentrasi………... 41 Tabel V. Hasil uji aktivitas antioksdan kuersetin dengan metode

DPPH... 45 Tabel VI. Hasil uji aktivitas antioksdian fraksi daun benalu dengan

metode DPPH………... 47

Tabel VII. Hasil Perhitungan IC50 Kuersetin dan Fraksi etil asetat daun

benalu………... 48

Tabel VIII . Kekuatan antioksidan dengan metode DPPH……….. 48

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1. Hasil Uji Pendahuluan Aktivitas Antioksidan (A= DPPH +

Metanol; B = DPPH+Fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu Scurrula ferruginea + Metanol; C = DPPH + Kuersetin + Metanol; D = Metanol + Fraksi etil asetat ekstrak etanolik benaluScurrula ferruginea; E = Kuersetin +

Metanol)………... 31 Gambar 2. Hasil Uji Pendahuluan Keberadaan Senyawa Fenolik dalam fraksietil

asetat ekstrak etanolik daun benalu Scurrula ferruginea(A = kontrol positif [asam galat+reagen

Folin-Ciocalteu+ Na2CO3 +metanol]; B = larutan uji fraksi+reagen Folin-Ciocalteu+ Na2CO3 +metanol; C = Asam galat+

Metanol; D = Larutan blangko[air+metanol+reagen Folin

Ciocalteu+Na2CO3], E = Fraksi +metanol) .……... 33 Gambar 3. Grafik penentuan operating timeasam galat..………... 35 Gambar 4. Grafik penentuan operating time fraksi etil asetat... ... 35 Gambar 5. Kurva baku asam galat dalam penetapan fenolik total……….. 37 Gambar 6. Grafik penentuan operating time kuersetin……… 42 Gambar 7. Grafik penentuan operating time fraksi etil asetat…………... 42 Gambar 8. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan

Kuersetin ………... 46 Gambar 9. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan fraksi

daun benalu………... 46

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Hasil determinasi tumbuhan benalu……… 56

Lampiran 2. Gambar (foto) tumbuhan benalu dan tanaman T. aurea... 57

Lampiran 3. Perhitungan penimbangan dan rendemen ekstrak dan fraksi Daun benalu………. 58

Lampiran 4. Penetapan kandungan kandungan fenolik total…………... 59

a. Asam galat……… 59

b. Fraksi etil asetat……… 60

Lampiran 5. Optimasi penentuan kandungan fenolik total……….. 62

a. Penentuan operating time asam galat……….. 62

b. Penentuan operating time fraksi……….. 63

c. Penentuan maksimun asam galat……….. 64

Lampiran 6. Penimbangan DPPH uji aktivitas antioksidan……… 66

Lampiran 7. Uji aktivitas antioksidan kuersetin………... 67

1. Penimbangan Kuersetin ……….. 67

2. Konsentrasi larutan induk……… 67

3. Perhitungan nilai IC50kuersetin ……….. 69

4. Penentuan operating time Kuersetin……….... 70

Lampiran 8. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan………... 73

Lampiran 9. Uji aktivitas antioksidan fraksi………... 75

1. Penimbangan fraksi etil asetal………. 75

2. Konsentrasi fraksi etil asetat……… 75

3. Perhitungan nilai IC50 fraksi etil asetat………... 77

4. Penentuan Opertating time fraksi etil asetat……… 78

INTISARI

Tumbuhan dalam dunia kesehatan dapat digunakan sebagai salah satu pendekatan terapi bahan alam yang ampuh untuk pengobatan berbagai penyakit.Pengobatan menggunakan tumbuhan Scurrula ferruginea (Jack) Danser dapat diterapkan untuk mengobati beberapa gangguan kesehatan pada tubuh manusia yang disebabkan oleh radikal bebas. Scurrula ferruginea (Jack) Danser tersebut mengandung kuersetin yang merupakan salah satu senyawa antioksidan.Penelitian ini bertujuan untukmengetahui aktivitas antioksidanmenggunakan metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidazil)berdasarkan nilai IC50dan jugamelakukan penetapan kadar fenolik total menggunakan metode reagen Folin-Ciocalteu yang dinyatakan dengan milligram (mg) ekuivalen asam galat per gram (g) fraksi. Penentuan aktivitas antioksidan dan penetapan kadar fenolik total tersebut menggunakan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser yang tumbuh pada tanaman (Tabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore).

Penentuan aktivitas antioksidan menggunakan spetrofotometer Uv-Vis pada panjang gelombang maksimum 515 nm dan penetapan kadar fenolik total dari fraksi etil asetat menggunakan spektrofotometer Uv-Vis pada panjang gelombang maksimum 739 nm.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S.ferruginea(Jack) Danser pada tanaman (Tabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore) memilik nilai IC50 sebesar(60,44 ± 2,16) µg/mL dan tergolong memiliki aktivitas antioksidan aktif atau kuat. Kemudian kadar fenolik total sebesar (49,87 ± 0,1838)mg ekuivalen asam galat per gram fraksi.

Kata kunci: Scurrula ferruginea (Jack) Danser, Tabebuia aurea Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore, DPPH, IC50, antioksidan, fenolik, spetrofotometri Uv-Vis, Folin-Ciocalte, ekstraksi dan fraksinasi.

ABSTRACT

The plants in the world of health can using as one therapeutic approach potent natural ingredients for the treatment of various diseases. Treatment using Scurrula ferruginea (Jack) Danser plants can be applied to treat some health problems in the human body caused by free radicals. Scurrula ferruginea (Jack) Danser contains quercetin which is one antioxidant compound.This study aims to determine antioxidant activity using DPPH (1,1-diphenyl-2-pikrilhidazil) method based on IC50 values and also determination of total phenolic content using the Folin-Ciocalteu reagent method to expressed by milligrams (mg) of gallic acid equivalents per gram (g) fraction.Determination of antioxidant activity and total phenolic assay using ethyl acetate fraction of ethanol extract of leaves mistletoes S. ferruginea (Jack) Danserthat grows on theTabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore.

The determination of antioxidant activity using spetrofotometer Uv-Vis at maximum wavelength 515 nm and the assay of the total phenolic fraction of ethyl acetate using Uv-Vis spectrophotometer at a wavelength of 739 nm maximum.

The results showed that the ethyl acetate fraction of ethanol extract of the leaves on the plant mistletoes S. ferruginea (Jack) Danser of Tabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore having an IC50 value of (60.44 ± 2.16) mg/mL and classified as having active or strong antioxidant activity. Then the total phenolic content was (49.87 ± 0.1838) mg gallic acid equivalents per gram fractions.

Keywords: Scurrula ferruginea (Jack) Danser, Tabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore, DPPH, IC50, antioxidants, phenolic, spetrofotometri Uv-Vis, Folin-Ciocalte, extraction and fractionation.

BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang

Antioksidan adalah senyawa pemberi elektron (elektron donor) atau reduktan yang mampu menangkap senyawa asing yang bersifat sebagai radikal bebas (senyawa yang memiliki elektron tidak berpasangan) (Winarsi, 2007). Antioksidan tersebut bekerja dengan mendonorkan atom hidrogen ke radikal yang memiliki gugus hidroksil sehingga terbentuk sebuah molekul yang tidak berbahaya yaitu air (Youngson, 2005).

Radikal bebas itu sendiri merupakan atom atau molekul yang memiliki elektron tidak berpasangan (unpaired electron). Radikal bebas memiliki dua sifat yaitu reaktivitas tinggi, karena kecenderungan menarik elektron dan dapat mengubah suatu molekul menjadi radikal baru lagi sehingga terjadi reaksi rantai (chain reaction). Reaksi rantai tersebut baru berhenti apabila radikal bebas dapat diredam (quenched) oleh senyawa yang bersifat antioksidan (Suryohudoyo, 1993).

Berdasarkan sumbernya antioksdan dibedakan menjadi 2 yaitu antiosidan alami dan sintetik. Antioksidan alami berasal dari tumbuhan yaitu senyawa fenolik dan polifenolik yang dapat berupa golongan flavonoid (golongan fenol alami terbesar), turunan asam sinamat, kumarin, tokoferol dan asam-asam organil polifunsional (Suranto, 2011). Sedangkan antioksidan sintetik berupa butil

hodroksilanisol, butil hidrositoluen, propil gallat, dan etoksiquin (Rahmawati et al., cit Cahyadi, 2006).

Dewasa ini, diantara berbagai jenis tumbuhan didunia, tumbuhan benalu adalah salah satu jenis tumbuhan yang sering dilakukan penelitiannya mengeni sifat aktivitas antioksidan dan kandungan fenolik total. Salah satu contoh penelitian yang dilakukan oleh Marvibaigia et al., (2014) dari Malaysia tentang kandungan fenolik total, antibakterial dan aktivitas antioksidan dari benalu Scurrula ferruginea (Jack) Danser. Hasil penelitian tersebut menyatakan benalu memiliki aktivitas antioksidan dan kandungan fenolik totalnya dengan hasil 144,217±0,66 mg ekivalen asam galat per gram ekstrak benalu, namun tidak menyatakan inang S. ferruginea (Jack) Danser itu hidup. Karena menurut Adler (2002), setiap inang yang berbeda memilik kualitas senyawa aktif atau nutrisi yang berbeda.

Benalu dikenal sebagai tumbuhan penggangu yang kehidupannya bergantung pada inang yang masih hidup atau dikenal dengan istilah parasit dan bersifat merugikan sehingga jarang dianggap berguna oleh berbagai kalangan masyarakat, tetapi dengan berbagai penelitian yang dilakukan telah menyatakan bahwa benalu sangat bermanfaat sebagai obat. Benalu juga memiliki keunikan tersendiri yaitu benalu yang sama dapat tumbuh pada inang yang berbeda dan sebaliknya benalu yang berbeda dapat tumbuh pada inang yang sama (Soejono, 1995).

Benalu biasanya hidup dan tumbuh pada batang atau dahan pohon dan dapat dijumpai dengan mudah pada pohon-pohon besar di daerah tropis seperti di Indonesia. Benalu itu sendiri memiliki kandungan senyawa aktif yang berbeda baik

jenis senyawa maupun jumlah kadar senyawa yang ada di dalamnya, itu semua tergantung pada iklim, cuaca, dan inangnya.

Pada penelitian ini akan dilakukan uji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan nilai IC50 dan penetapan kadar fenolik total dari fraksi etil asetat ekstrak etanol benalu S. ferruginea (Jack) Danser pada tanaman T. aurea (sebagai inang benalu). Scurrula ferruginea (Jack) Danser juga merupakan salah satu tumbuhan benalu yang mengandung senyawa antioksidan terbesar yaitu fenolik (Marvibaigia et al., (2014) dan tumbuhan T. aurea mengandung sterol, alkaloid dan flavonoid (senyawa fenol) (Kambampati et al., 2015).

B. Keaslian penelitian

Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang benalu S. ferruginea (Jack) Danser pernah dilakukan oleh Marvibaigia et al., (2014) yaitu mengetahui kadar fenolik total, antioksidan dan sifat antibakterial dari ekstrak aseton bunga, daun dan batang S. ferruginea (Jack) Danser. Kapasitas antioksidan, dan kandungan total fenolik dari ekstrak dievaluasi menggunakan metode DPPH dan uji Folin Ciocalteu.

Perbedaan antara penelitian ini dengan penelitian Marvibaigia et al., (2014), adalah pelarut yang digunakan pada proses ekstraksi yaitu pada Marvibaigia et al., (2014) menggunakan aseton dan sedangkan pada penelitian ini ekstraksinya menggunakan etanol dan difraksinasi menggunakan etil asetat.

C. Perumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut:

1. Berapakah kadar fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser di tanaman T. aurea dinyatakan dengan berat ekivalen asam galat?

2. Berapakah nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser di tanaman T. aurea menggunakan metode radikal DPPH yang dinyatakan dengan IC50?

D. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum :

Menguji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser di tanaman T. aurea dengan menggunakan metode radikal DPPH.

2. Tujuan khusus:

a. Melakukan penetapan kadar fenolik total dari fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser di tanaman T. aurea menggunakan metode Folin-ciocalteu.

b. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser di tanaman T. aurea dengan menggunakan metode radikal DPPH yang dinyatakan dengan nilai IC50.

E. Manfaat Penelitian 1. Manfaat teoritis :

Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberi pengetahuan tentang adanya aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser pada inang T. aurea menggunakan metode radikal DPPH yang dinyatakan dengan nilai IC50.

2. Manfaat praktis :

Hasil dari penelitian ini diharapkan bagi peneliiti selanjutnya dan masyarakat bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser pada inang T. aurea dapat dimanfaatkan sebagai antioksidan.

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Benalu Scurrula ferruginea (Jack) Danser

Scurrula ferruginea (Jack) Danser dikenal sebagai salah satu tanaman obat yang telah banyak digunakan dalam pengobatan tradisional untuk terapi herbal. Simplisia dari daun, batang dan bunga dari S. ferruginea (Jack) Danser digunakan oleh masyarakat untuk pengobatan tekanan darah tinggi, hipertensi dan kerusakan gastrointestinal (Dévéhat, 2002).

Ekstrak daun dan bunganya berdasarkan nilai IC50 memiliki aktivitas antioksidan yang terbaik dibandingkan batang. Berdasarkan aktivitas radikal DPPH semua ekstrak mentah benalu dari S. ferruginea (Jack) Danser merepresentasikan aktivitas antioksidan (Marvibaigia, 2014).

Scurrula ferruginea (Jack) Danser, termasuk anggota suku Loranthaceae dan memiliki sinonim yaitu Loranthus ferrugineus Jack, L. crysanthus DC, Dendrophthoe ferrugineus G. Don., Dendrophthoe crysanthus G. Don., Etubila ferrugineus Rafin., Loranthus crysanthoides Korth., Dendrophthoe crysanthoides Miq., S. chrysanthoides Danser (Scurrula ferruginea (Jack) Danser, 2003). Scurrula ferruginea Danser memiliki nama daerah Jawa: Kemladean, pasilan, benalu, ambai-ambai (Lemmens et al, 1999 dan Anonim, 1995).

Deskripsi tanaman; berupa terna, parasit obligat dengan batang menggantung berkayu silindris berbintik-bintik coklat. Bunganya; majemuk, berbentuk payung,

terdiri dari 4-6 bunga di ketiak daun atau di ruas batang, tangkainya pendek, kelopak berbentuk kerucut terbalik, panjangnya kurang lebih 3 mm bergigi empat, benang sarinya memilki panjang 2-3 mm, kepala putik bentuk tombol, tabung mahkota panjang 1-2 cm, tajuk mahkota melengkung ke dalam dan berwarna merah. Daun tunggal, berhadapan, lonjong, ujung agak meruncing, pangkal membulat tepi rata, panjang 5-9 cm, lebar 2-4 cm, permukaan atas hijau, permukaan bawah coklat. Buahnya; berbentuk kerucut terbalik, panjang kurang lebih 8 mm dan berwarna coklat. Bijinya berbentuk bulat kecil dan berwarna hitam. Akar; menempel pada pohon inang, berfungsi sebagai penghisap, yang berwarna kuning kecoklatan. Simplisia S. ferruginea (Jack) Danser memiliki helaian daun berwarna hijau keabu-abuan sampai hijau kecoklatan dengan permukaan bawah dipenuhi seperti rambut-rambut daun yang berwarna kecoklatan, berkerut, berbentuk bulat telur sampai lonjong, ujung meruncing, tepinya rata danmenggulung, panjang 3-6 cm, dan lebar 1-3 cm. Tangkai daunnya pendek,dan berkerut ; ranting berwarna coklat kehitaman, dan berkerut. Bau simplisianya khas, dan rasanya pahit (Scurrula ferruginea (Jack) Danser, 2003).

Habitat alami dari tanaman ini terdapat di Malaysia, Sumatera, India, Australia, dan Selandia Baru (Ameer et al., 2010). Herba Scurrula mengandung senyawa asam lemak: asam oleat, asamlinoleat, asam linolenat, asam oktadeka-8-10-dinoat, asam (Z)-oktade-12-ena-8-10-dioat dan asam oktadeka-8-10-12-trinoat; kuersitrin, kuersetin, rutin, ikarisid B2, avikulin, (+)-katekin, epikatekin, (-)-epikatekin3-O-galat dan (-) epigalokatekin-3-O-galat (Devehat et a.l, 2002).

Tumbuhan Scurrula ferruginea (Jack) Danser diklasifikasikan sebagai berikut : Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta (Vascular plants/Piante vascolari) Division : Magnoliophyta

Superdivison : Spermatophyta Class : Magnoliopsida Subclass : Rosidae Order : Santalales Family : Loranthaceae Genus : Scurrula L.

Species : Scurrula ferruginea (Jack) Danser

(China checklist of higher plants, 2015). B. Tabebuia aurea ( Pohon bunga terompet/lonceng )

Tabebuia aurea yang berasal dari Paraguay umumnya dikenal sebagai lonceng emas (golden bell) atau pohon trompet Karibia, dan merupakan genus terbesar darikeluarga bignoniaceae dengan 293 spesies (Agarwal dan Chauhan, 2015).

Tabebuia aurea merupakan salah satu pohon berbunga yang spektakuler diantara pohon-pohon berbunga lainnya dikarenakan bunga dari T. aurea mulai bermekaran ketika pohon mulai kehilangan daunnya atau berbunga tanpa daun. Daun T. aurea memiliki dua warna daun yang berbeda; hijau dan abu-abu keperakan (Silverygray). Bunganya berbentuk corong, berwarna kuning cerah dengan panjang

tiga setengah inci dan diameter inci. Dan memiliki buah berbentuk seperti kapsul, lonjong, warnya keabu-abuan coklat, sedikit berkayu dan panjangnya kurang lebih enam inci. Pohon T. aurea pada usia tua akan kekuatan untuk bertahan walapun diterpa angin topan dan dapat tumbuh dengan baik diberbagai tanah dan membutuhkan sedikit perawatan (Brown, 2000).

Ekstrak etanol daun T. aurea mengandung sterol, alkaloid dan flavonoid. Penggunakan metode diet lemak tinggi aterosklerosis dengan menginduksikan ekstrak etanol daun T. aurea pada tikus Wistar, menyatakan bahwa ekstrak etanol daun T. aurea berpotensi sebagai anti-aterosklerosis (Kambampati et al., 2015).

Tanaman Tabebuia aurea diklasifikasikan sebagai berikut : Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta Superdivision : Spermatophyta Divison : Magnoliophyta Class : Magnoliopsida Subclass : Asteridae Order : Scrophulariales

Family : Bignoniaceae – Trumpet-creeper family Genus : Tabebuia Gomes ex DC, - trumpet-tree

Species : Tabebuia aurea (Silva Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore (Hogan, 2013).

C. Radikal Bebas

Para ahli biokimia menyebutkan bahwa radikal bebas merupakan salah satu bentuk senyawa oksigen reaktif, yang secara umum diketahui sebagai senyawa yang memiliki elektron yang tidak berpasangan. Senyawa ini terbentuk di dalam tubuh, dipicu oleh bermacam-macam faktor, misalnya ketika komponen makanan diubah menjadi bentuk energi melalui proses metabolisme. Pada proses metabolisme ini, sering kali terjadi kebocoran elektron. Dalam kondisi demikian, mudah sekali terbentuk radikal bebas, seperti anion superoksida, hidroksil dan lain-lain(Youngson, 2005).

Radikal bebas juga terbentuk terus-menerus di dalam tubuh secara tanpa disadari, tidak hanya melalui proses metabolisme sel normal, namun juga oleh peradangan, kekurangan gizi, dan akibat respon terhadap pengaruh diluar tubuh. Seperti halnya polusi udara, ultraviolet (UV), dan lain-lain (Winarsi, 2007). Radikal bebas yang terbentuk berlebihan akan menyebabkan antioksidan seluler tidak dapat menetralkannya sehingga berakibat kerusakan pada sel. Radikal bebas ini dapat dinetralisir oleh senyawa antioksidan seperti flavonoid, fenolat, dan alkaloid. Senyawa antioksidan ini akan menyerahkan satu atau lebih elektron kepada radikal bebas sehingga menjadi molekul yang normal kembali dan mampu menghentikan beberapa kerusakan sel (Erawati, cit Agarwal et al., 2006).

D. Antioksidan

Konsumsi antioksidan dalam jumlah memadai dilaporkan dapat menurunkan kejadian penyakit degeneratif, seperti kardiovaskuler, kanker, aterosklerosis, osteoporosis, dan lain-lain. Konsumsi makanan yang mengandung antioksidan juga disebut-sebut dapat meningkatkan status imunologis dan menghambat timbulnya penyakit degeneratif akibat penuaan. Oleh sebab itu, kecukupan asupan antioksidan secara optimal diperlukan pada semua kelompok umur (Winarsi, 2007).

Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (elektron donor) atau reduktan. Senyawa ini memiliki berat molekul kecil, tetapi mampu menginaktivasi atau menghambat berkembangnya reaksi oksidasi dengan cara mencegah terbentuknya radikal. Akibatnya, kerusakan sel akan dihambat (Winarsi, 2011).

Berdasarkan sumbernya, antioksidan dapat dibedakan menjadi 2 macam yaitu antioksidan alami dan antioksidan sintetik. Antioksidan alami dapat ditemukan pada tanaman seperti biji-bijian, buah dan sayur-sayuran yang diantaranya mengandung senyawa turunan fenol yaitu koumarin, hidroksdinamat, tokoferol, difenol, flavonoid, dihidroflavon, kathekin dan asam askorbat (Suranto, 2011). Sedangkan antioksidan sintetik berupa butil hodroksilanisol, butil hidrositoluen, propil gallat, dan etoksiquin (Rahmawati et al., cit Cahyadi, 2006).

Antioksidan yang alami lebih banyak diminati sebagai antioksidan tambahan bagi tubuh dibandingkan antioksidan sintetik, karena antioksidan sintetik seperti butil hidrositoluen (BHT) diketahui dapat meningkatkan terjadi efek karsinogenesis (Umemura, et al., 2001).

E. Ekstrak

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Depkes RI, 2014).

Ekstrak cair adalah sediaan cair simplisia nabati, yang mengandung etanol sebagai pelarut atau sebagai pengawet. Ekstrak cair yang cenderung membentuk endapan, yang didiamkan dan disaring atau bagian yang bening diendapkan (DepkesRI, 2014).

F. Etanol

Etanol dihasilkan secara biologis melalui fermentasi gula atau pati.Enzim yang ada dalam ragi atau kultur bakteri mengkatalisis reaksi dengan tanpa oksigen.

C6H12C6(aq) + H2O(aq) enzim 2CH3CH2OH (aq) + 2CO2 (g)

(etanol)

Etanol mempunyai penyerapan tidak terbilang sebagai pelarut untuk bahan kimia organik dan sebagai senyawa awal untuk pembuatan zat warna, obat-batan sintetis, kosmetik, dan bahan-bahan peledak. Etanol merupakan bagian dari minuman beralkohol dan satu-satunya jenis alkohol rantai lurus yang tidak beracun (lebih tepatnya, paling sedikit beracun); dan badan kita juga menghasilkan suatu enzim, yang disebut alkohol dehidrogenase, yang membantu metabolisme etanol dengan mengoksidasinya menjadi asetaldehida (Chang, 2005).

G. Senyawa Fenolik

Fenolik merupakan senyawa yang banyak ditemukan pada berbagai tumbuhan dan memiliki cincin aromatik dengan satu atau lebih gugus hidroksi (OH). Senyawa ini diberi nama berdasarkan senyawa induknya yaitu fenol. Senyawa fenolik diklasifikasikan menjadi dua golongan yaitu tidak larut seperti lignin dan yang larut seperti asam fenolik, phenylpropanoids, flavonoid, dan kuinon. Beberapa penelitian telah membuktikan bahwa senyawa fenolik memiliki berbagai efek biologis seperti memiliki aktivitas antioksidan (Indrawati dan Razimin, 2013).

H. Metode DPPH

DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidazil) adalah suatu radikal yang memiliki kemampuan untuk direduksi oleh suatu antioksidan dan dapat diukur dengan melihat penurunan nilai absorbansi pada panjang gelombang 517 nm sehingga DPPH dapat digunakan untuk mengukur kapasitas penangkapan senyawa radikal (Rosida et al., cit Duh, 1999). Parameter aktivitas antioksidan dilihat dari nilai IC50. IC50 merupakan konsentrasi yang menyebabkan penurunan 50% dari konsentrasi DPPH awal (Molyneux, 2004).

Metode radikal bebas DPPH merupakan metode pengukuran antioksidan yang sederhana, cepat, peka, memerlukan sedikit sampel dan tidak membutuhkan banyak pelarut seperti halnya uji lain (xantin-xantin oksidase, metode tiosianat, antioksidan total). Hasil pengukuran menunjukkan kemampuan antioksidan sampel secara umum dalam menghambat radikal bebas (Juniarti et al., 2009).

I. Metode Spetrofotometri

Metode pengukuran menggunakan prinsip spektrofotometri adalah berdasarkan absorpsi cahaya pada panjang gelombang tertentu melalui suatu larutan yang mengandung kontaminan yang akan ditentukan konsentrasinya. Proses ini disebut absorpsi spektrofotometri, dan jika panjang gelombang yang digunakan adalah gelombang cahaya tampak, maka disebut kolorimetri karena memberikan warna. Selain gelombang cahaya tampak, spektrofotometri juga menggunakan panjang gelombang pada gelombang ultraviolet dan inframerah. Prinsip kerja dari metode ini adalah jumlah cahaya yang diabsorpsi oleh larutan sebanding dengan konsentrasi kontaminasi dalam larutan. Prinsip ini biasanya dijabarkan dalam rumus Hukum Lambert-Beer, yang menghubungkan antara absorbansi cahaya dengan konsentrasi pada suatu bahan yang mengabsorpsi (Lestari, 2010).

J. Landasan Teori

Scurrula ferruginea (Jack) Danser merupakan benalu yang dapat tumbuh pada berbagai tanaman inang. Inang yang berbeda dapat menyebabkan kandungan kimia pada benalu berbeda pula, khususnya kandungan senyawa yang berfungsi sebagai antioksidan yaitu fenolik. Tingginya kandungan fenolik menentukan daya aktivitas antioksidan semakin tinggi. Oleh sebab itu untuk mengetahui aktivitas antioksidan dan kandungan fenoliknya dari sebuah benalu perlu dilakukan metode-metode pengujian yang sesuia.

Metode yang dilakukan untuk mengetahui adanya senyawa antioksidan dan aktivitasnya menggunakan metode DPPH sedangkan untuk mengetahui keberadaan

dan penetapan kandungan fenolik totalnya adalah menggunakan metode Folin-ciocalteu. Kedua metode tersebut akan digunakan lagi dengan bantuan alat spektrofometer UV-vis untuk mengetahui aktivitas antioksadan pada panjang gelombang 517 nm dan penetapan kadar total fenolik pada panjang gelombang 750 nm.

K. Hipotesis

Hipotesis dalam penelitian ini yaitu fraksi etil asetat dari ekstrak etanoldaun S. ferruginea (Jack) Danser pada tanaman T. aurea memiliki kandungan fenolik yang dinyatakan dengan masaa ekivalen asam galat per gram fraksi dan memiliki daya antioksidan yang dinyatakan dengan nilai IC50.

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak sederhana.

B. Variabel

1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun S. ferruginea (Jack) Danser.

2. Variabel tergantung berupa aktivitas antioksidan (%IC) fraksi etil asetat ekstrak etanol daun S. ferruginea (Jack) Danser.

3. Variabel pengacau terkendali berupa waktu pemanenan, cara dipanen, dan jumlah (g) serbuk daun yang digunakan.

4. Variabel pengacau tak terkendali berupa cuaca atau musim, dan kemlembapan. C. Definisi Operasional

1. Simplisia herba S. ferruginea (Jack) Danser adalah simplisia yang dibuat dari tumbuhan S. ferruginea (Jack) Danser pada tanaman inang T. aurea yang berada di komplek Universitas Sanata Dharma Kampus III Yogyakarta.

2. Ekstrak etanol adalah ekstrak benalu S. ferruginea (Jack) Danser yang diperoleh dengan cara maserasi dengan pelarut etanol : air (9:1) dan (1:1) kemudian dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator.

3. Fraksi etil asaetat adalah hasil fraksinasi ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser yang telah diekstraksi cair-cair dengan air : washbensin (1:1) dan kemudian difraksinasi menggunakan etil asetat.

4. IC50 adalah persen konsentrasi fraksi etil asetat yang mampu menghambat 50% aktivitas radikal bebas menggunakan spektrofotometer Uv-vis.

D. BahanPenelitian

1. Bahan Utama : Benalu S. ferruginea (Jack) Danser dari T. aurea di lingkungan Universitas Sanata Dharma Kampus 3 Paingan, Maguoharjo, Sleman, Yogyakarta. 2. Bahan Kimia : Bahan kualitas p.a. E. Merck, yaitu metanol p.a ; bahan kualitas

p.a. Sigma Chem. Co., USA, yaitu Larutan DPPH (1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil), reagen Folin-Ciocalteu, asam galat dan kuarsetin ; bahan kualitas teknis Brataco Chemica di antaranya: etil asetat, etanol dan alumunium foil

E. Alat Penelitian

Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain adalah: neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP 160p), vacum rotary evaporator (Junke dan Kunkel), waterbath (labo-tech, Heraeus), vortex (Janke dan Kunkel), spektrofotometer UV-vis (Perkin Elmer Lamda 20), blender, corong Bucher, oven, mikropipet 10-1000µL; 1-10 mL (Acura 835, Socorex), tabung reaksi bertutup, alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki).

F. Tata Pelaksanaan Penelitian 1. Determinasi tanaman

Determinasi dilakukan adalah pada benalu S. ferruginea (Jack) Danser dari inang tanaman pohon bunga terompet (Tabebuia aurea) dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta oleh Yohanes Dwiatmaka, M.Si. determinasi dilakukan dengan cara membandingkan cirri dan sifat berdasarkan Flora of China.

2. Pengumpulan bahan

Benalu S. ferruginea (Jack) Danser dari tanaman T. aurea diperoleh dari Kampus III Universitas Sanata Dharma Paingan, Maguoharjo, Sleman, Yogyakarta. Waktu panen tanaman benalu dilakukan pada musim penghujantanggal 9 bulan November 2014. Pemanenan yang dilakukan adalah memanen semua benalu S. ferruginea (Jack) Danser yang tumbuh pada T. aurea.

3. Preparasi sampel

Bagian benalu S. ferruginea (Jack) Danser yang dikumpulkan yaitu daunnya. Selesai daun benalu tersebut dikumpulkan dilakukan pembersihan dengan pencucian menggunakan air bersih mengalir. Selanjutnya dilakukan proses pengeringan pada sinar matahari dengan ditutupi kain hitam hingga benalu menjadi sangat kering agar kadar air dalam daun tidak terlalu banyak karena jika kadar airnya banyak maka bisa menggangu dalam kualitas penetapan kadar fenoliknya.

Setelah daun benalu tersebut dikeringkan kemudian dihancurkan menjadi serbuk menggunakan blender lalu diayak dan dipindahkan pada wadah tertutup yang tidak mudah mengalami kelembaban. Serbuk dari sampel ditimbang 50 gram lalu dimasukkan dalam labu Erlenmeyer 500ml dilakukan menggunakan tiga labu Erlenmeyer dengan masing-masing labu 50 gram serbuk daun benalu.

Labu Erlenmeyer yang terisi serbuk dimaserasi selama 3 hari menggunakan pelarut etanol 70% dengan bantuan shaker. Lalu maserat disaring menggunakan kertas saring melalui corong buchner sehingga menghasilkan filtrat, kemudianampas dimaserasi kembali dengan etanol selama 1hari, hingga filtrat hampir tidak berwarna.

Semua filtrat disatukan dan dipekatkan dengan menggunakan vacuum rotatary evaporator sampai tidak ada lagi cairan yang menetes pada kondensor sehingga diperoleh ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser. Ekstrak etanolik daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser dipanaskan pada waterbath hingga bobot tetap kemudian diekstraski cair-cair menggunakan air hangat + washbensin (1:1v/v). Fase air diambil lalu diekstraksi cair-cair menggunakan etil asetat dengan perbandingan fraksi air-etil asetat (1:1 v/v). Lalu dipisahkan antara fraksi air dan etil-asetat. Fraksi etil-asetat pelarutnya diuapkan menggunakan vacuum rotatary evaporator. Hasil fraksi tersebut ditampung dalam cawan porselen yang telah dihitung bobot tetap dan kemudian fraksinya dipanaskan hingga mendapat bobot tetap lalu ditutup dengan alumunium foil lalu disimpan didalam desikator untuk digunakan pada analisis lebih lanjut.

4. Ujikandungan fenolik

a) Pembuatan larutan baku asam galat

Asam galat ditimbang sebanyak 10,0 mg dilarutkan dalam campuran 10 mL akuades:metanol (1:1) sehingga diperoleh konsentrasi larutan asam galat 1000,0 µg/mL. Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 mL larutan tersebut laluditambahkan metanol p.a sampai batas sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100; 125; 150 µg/mL.

b) Pembuatan larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik

Fraksi etil asetat ditimbang sebanyak 10,0 mg, lalu ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 1000,0 µg/mL. Kemudian diambil 1,0 mL larutan tersebut dan ditambahkan 10,0 mL metanol p.a sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 100 µg/mL.

c) Uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolik

Sejumlah 0,5 mL larutan uji 100,0 µg/mL dan larutan pembanding asam galat 150,0 µg/mL masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditambah 2,5 mL peraksi fenol Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan aquades (1:10 v/v). Larutan didiamkan selama 10 menit, lalu ditambahkan 2 mL larutan natrium karbonat 1M, kemudian dihomogenkan dengan vortex selama 30 detik. Perubahan warna larutan menjadi biru menunjukkan keberadaan golongan senyawa fenolik.

d) Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total 1. Penentuan Operating time

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; 150 µg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnyaditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Setelah itu absorbansinya dibaca menggunakan spetrofotometer Uv-vis pada panjang gelombang 750 nm setiap selang waktu 5 menit selama 30 menit. Kemudian dilakukan juga untuk larutan uji setiap selang waktu 5 menit selama 60 menit menggunakan konsentrasi 100 µg/mL 2.Penentuan panjang gelombang serapan maksimum

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; 150 µg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnyaditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Kemudian didiamkan selama operating time, dibaca panjang gelombang pada serapan maksimum menggunakan spektrofotometri visibel dengan range panjang gelombang 600-800 nm.

3. Pembuatan kurva baku asam galat

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; 150 µg/mL ditambahdengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Setelah OT, absorbansinya dibaca λ max terhadap blanko yang terdiri atas aquades;metanol p.a (1:1), reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1M. Pengerjaannya dilakukakan 3 kali.

4. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji

Sebanyak 0,5 mL larutan uji 100µg/mL, dimasukkan kedalam labu takar 10,0 mL dan dilanjutkan sebagaimana perlakuam pada pembuatan kurva baku asam galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai miligram ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat, dilakukan 3 kali replikasi.

5. Uji aktivitas antioksidan 1) Pembuatan larutan DPPH

Sebanyak 15,8 mg DPPH dilarutkan dengan metanol p.a hingga 100,0 mL, sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan aluminum foil dan harus selalu dibuta baru.

2) Pembuatan larutan stok kuersetin

Kuersetin ditimbang sebanyak 10,0 mg dilarutkan dengan metanol p.a 10,0 mL hingga tanda batas.

3) Pembuatan larutan intermediet dan larutan baku pembanding (kuersetin)

Larutan stok kuersetin diambil sebanyak 1,0 ml kemudian diencerkan dengan metanol p.a hingga 10,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi larutan intermediet standar kuersetin sebesar 100 µg/mL. Kemudian larutan intermediet dengan konsentrasi 100 µg/mL diambil 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 dan 1,5 mL larutan tersebut ditambah metanol p.a 10,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku pembanding kuersetin sebesar 5,0; 7,5; 10,0; 12,5 dan 15,0 µg/mL.

4) Pembuatan larutan uji untuk aktivitas antioksidan

Fraksi etil asetat ditimbang sebanyak 10,0 mg dan ditambahkan 10 mL metanol p.a sampai tanda batas sebagai stok larutan uji. Kemudian diambil 1,0 mL larutan stok larutan uji dan ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL sebagai larutan intermdiet sehingga diperoleh konsentrasi 100,0 µg/mL. Lalu diambil sebanyak 6; 6,25; 6,50; 6,75; 7,0 mL larutan tersebut, kemudian masing-masing ditambahkanmetanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 60,0; 62,5; 65,0; 67,5; 70,0µg/mL.

5) Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Sebanyak 1 mL larutan DPPH masing-masing dimasukkan ke dalam tiga buah tabung reaksi. Selanjutnya masing-masing ditambah 1 mL metanol, larutan pembanding kuerstin 37,5 µg/mL, dan larutan uji 200 µg/mL. Selajutnya larutan ditambah dengan 3 mL metanol. Kemudian larutan dihomogenkan dengan vortex selama 30 detik. Perubahan warna larutan menjadi kekuningan menunjukkan adanya aktivitas antioksidan.

6) Optimasi metode uji aktivitas antioksidan a. Penetuan panjang gelombang

Pada tiga labu ukur 10,0 mL, dimasukan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mL larutan DPPH. Larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batassehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,20; 0,040; dan 0,060 mM. Larutan tersebut kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik. Diamkan selama operating

time, lalu dilakukan scaning panjang gelombang serapan maksimum spektrofotometer Uv-visibel pada panjang gelombang 400-600 nm.

b. Penentuan operating time

Sebanyak 2,0 mL larutan DPPH dimasukan kedalam masing-masing tiga labu ukur 10,0 mL, ditambahkan masing-masing dengan 2,0 mL larutan pembanding kuersetin 5,0; 10,0; 15,0 µg/mL. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas labu ukur 10,0 mL. Larutan tersebut kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spetrofotometer pada panjang gelombang 515 nm selama 1 jam.Kemudian dilakukan juga untuk larutan uji 6,0 ; 65; 70µg/mL.

7) Uji aktivitas antioksidan

1. Pengukuran absobansi larutan DPPH (kontrol)

Pada labu ukur 10 mL, dimasukkan sebanyak 2 mL larutan DPPH dan larutan tersebut ditambahkan dengan metanol hingga batas. Kemudian larutan dibaca absorbansinya pada saat OT (35 menit) dan panjang gelombang serapan maskimum yaitu 515 nm. Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali.

2. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan larutan uji

Sebanyak 2 ml larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing-masing labu ukur 10 mL yang sudah tersedia 5 labu ukur untuk larutan penbanding dan 5 labu ukur untuk larutan uji dengan konsentrasi berbeda-beda. Kemudian ditambah dengan 2 mL larutan pembanding pada labu ukur untuk larutan pembanding dan 2 ml larutan uji pada labu ukur untuk larutan uji. Selanjutnya campuran larutan tersebut

masing-masing ditambah dengan metanol hingga tanda batas. Masing-masing-masing larutan tersebut kemudian dihomogenkan dengan vortex selama 30 detik dan didiamkan selama OT (30 menit). Larutan dibaca aborbansinya dengan spektrofotometer Uv-visibel pada panjang gelombang serapan maksimum hasil optimasi, yaitu 516 nm. Pengujian dilakukan dengan 3 kali replikasi.

3. Estimasi aktivitas antioksidan

Data hasil pengukuran absorbansi larutan uji (fraksi etil asetat S. ferruginea senyawa pembanding larutan rutin) digunakan untuk menghitung nilai %IC dan IC50. Aktivitas penagkapan radikal DPPH (%IC) dihitung dengan rumus :

Nilai aktivitas antioksidan yang dinyatakan dengan IC50 ditentukan dengan persamaan garis regresi linear antara konsentrasi larutan uji (sumbu X) dengan %IC (sumbu Y).

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tumbuhan

Determinasi bertujuan untuk mengetahui dan memastikan kebenaran taksonomi dari suatu tumbuhan berdasarkan struktur tumbuhan yang dilihat dari bentuk batang, daun, akar, dan bunga yang dilakukan sespesifik mungkin dan tepat sasaran karena tumbuhan mempunyai kemiripanvarietas yang terkadang membingungkan untuk berbagai penelitian. Determinasi tumbuhan benalu dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat (Lampiran 1) dengan acuan dari web efloras.org. Hasil determinasinya menunjukkan bahwa tumbuhan tersebut bernama Scurrula ferruginea (Jack) Danser.

B. Hasil Pengumpulan Bahan

Daun benalu diperoleh dari tanaman inang pohon bunga terompet yang berada dikomplek kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta. Pemanenan dilakukan pada tiga pohon yang sama dilokasi yang berdekatan dikarenakan jumlah daun benalu yang didapat terbatas sehingga diambil pada ketiga pohon yang ada tumbuhan benalu S. ferruginea (Jack) Danser.

Waktu pemanenan dilakukanpada pukul 10.00 pagi tanggal 9 November 2014 pada saat tanaman inang selesai berbungadan daun yang digunakan adalah daun yang tidak rusak atau tidak kering. Pemanenan dilakukan pada pagi hari untukmemperoleh kandungan metabolitsekunder yang maksimal. Sebab jika dilakukan pada siang atau

sore hari metabolit sekunder yang berperan sebagai antioksidan akan berkurang ketika sudah terpapar sinar UV dari matahari.

C. Hasil Preparasi

Preparasi sampel dilakukan untuk mendapat fraksi etil asetat dari ekstrak etanolik daun benalu yang diduga dalam fraksi tersebut mengandung senyawa fenolik. Setelah pemanenan, dilakukan sortasi basah dan pencucian dengan air mengalir bersih untuk memisahkan daun dari pengotor-pengotor seperti debu atau batu-batuan kecil yang menempel pada daun. Daun tersebut kemudian dirajang dan dikeringkan pada udara terbuka yang terlindung dari cahaya matahari langsung, agar komponen senyawa yang dinginkan terdapat didalam daun tidak mengalami kerusakan.

Pengeringan atau penjemuran dilakukan selama dua belas haridan dihentikan ketika daun benalu sudah rapuh. Kemudian daun disortasi kering untuk memisahkan lagi pengotor yang tercampur setelah pengeringan. Daun yang telah kering diserbukan menggunakan blender dan diayak untuk memperkecil ukuran partikel sehingga memperbesar luas permukaan serbuk agar mudah terbasahi oleh penyari secara merata.

D. Hasil Ekstraksi

Langkah selanjutnya yang dilakukan adalah ekstraksi menggunakan pelarut etanol yang berfungsi untuk menyari senyawa penting yang terkandung dalam tumbuhan benalu S. feruguinea (Jack) Danser. Menurut Laporniket al., (2005), pelarut yang digunakan adalah etanol dikarenakan mampu memisahkan senyawa

polifenol dengan lebih banyak dalam proses ekstraksi dibandingkan dengan pelarut air saja dan juga lebih efektif menembus dinding sel untuk menarik keluar senyawa polifenol dari dalam sel.

Pada penelitian ini menggunakan etanol 70% yang bersifat polar karena antioksidan alami atau senyawa fenolik pada umumnya bersifat polar sehingga sangat efektif dalam menghasilkan jumlah bahan aktif yang optimal, danjuga bahan pengotor hanya dalam skala kecil turut dalam cairan pengekstraski. menurut Suryanto et al (2011), ekstrak dengan menggunakan pelarut etanol memiliki kandungan flavonoid lebih tinggi dibandingkan ekstrak metanol dan aseton.

Ekstraksi yang dilakukan menggunakan metode maserasi yaitu sampel direndam dalam etanol 70% dan aquadest (9:1) selama 3 hari pada temperature kamar. Maserasi dilakukan dengan bantuan shaker sebagai alat penggojokan untuk mengoptimalkan kontak antara pelarut dengan serbuk sampel agar tidak terjadi pengendapan. Setelah maserasi dilakukan remaserasi menggunakan pelarut atau larutan penyari yang sama untuk memaksimalkan proses penyarian supaya memperoleh lebih banyak senyawa fenolik. Selama proses maserasi dan remaserasi menggunakan labu erlenmeyer yang dibungkus menggunakan alumunium foil yang bertujuan untuk mencegah terjadinya kerusakan senyawa.

Pada proses penyaringanmenggunakan bantuan pompa vaccum dan corong buchner untuk mempercepat proses dan mendapat hasil yang lebih banyak dibandingkan penyaringan secara biasa. Hasil penyaringan tersebutdiuapkan pelarut etanolnya dengan menggunakan alat vaccum rotary evaporator sehingga diperoleh

ekstrak etanolik pekat. Penguapan menggunakan rotary evaporator itu dikarenakan alat ini mampu menguapkan pelarut dibawah titik didih agar senyawa yang terkandung dalam ekstrak tidak mengalami kerusakan oleh suhu yang tinggi.

Ekstrak pekat tersebut di tampung dalam cawan kosong yang sudah ditimbangsebelumnya agar dapat dihitung bobot ekstrak. Kemudian ekstrak yang terdapat dalam cawan tersebut dipanaskan menggunakan waterbath untuk diuapkan lagi agar memperoleh ekstrak etanolik kering hingga mencapai bobot tetap. Bobot ekstrak kering yang diperoleh 14,33 gram dan rendemen yang didapat dari ekstrak daun benalu 9,5557%.

E. Hasil Fraksinasi Ekstrak

Menurut Devehat et a.l, 2002, daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser mengandung senyawa asam lemak; asam oleat, asam linoleat, dan asam oktadeka. Sehingga ekstrak etanolik kering tersebut diberi perlakuan ekstraksi cair-cair menggunakan washbensin dan berbanding air hangat, sehingga dapat dilihat pada corong pisah washbensin berada dibagian atas sedangkan air hangat berada dibagian bawah karena berat jenis air lebih besar dibandingkan washbensin. Wasbensin berfungsi menghilangkan senyawa-senyawa nonpolar yang tidak diharapkan seperti lipid dan klorofil karena washbensin juga bersifat nonpolar. Ekstraksi ini dilakukan sampai fase washbensin terlihat bersih atau tidak terlihat senyawa lipid dan klorofil. Setelah itu fase airnya diambil untuk difraksinasi cair-cair menggunakan etil asetat.

Pada tahap fraksinasi menggunakan etil asetat karena sifat senyawa etil asetat adalah polaryang bertujuan untuk menarik senyawa-senyawa fenolik yang juga

bersifat polar dan menurut Devehat et a.l, 2002, menyatakan bahwa daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser mengandung senyawa fenolik seperti ikarisid B2, avikulin, katekin, epikatekin, epikatekin3-O-galat dan epikgalokatekin-3-0-galat.Saat pelarut etil asetat dicampurkan bersama fase air maka yang terlihat bahwa fase etil asetat berada pada bagian atas dan fase air berada pada bagian bawah dikarenakan air memiliki berat jenis lebih besar dari etil asetat. Fraksinasi dilakukan sebanyak tiga kali.

Fase etil asetat dikumpulkan untuk dilakukan penguapan menggunakan vacuum rotary evaporator hingga tidak lagi terlihat tetesan etil asetat pada kondensor (pendingin) yang diembunkan tertampung pada labu alas bulat. Setelah dirotary, fraksi ditampung pada cawan porselin yang sebelumnya sudah ditimbang agar dapat dihitung berat fraksi tersebut lalu dikeringkan pada waterbath sampai memperoleh bobot tetap, kemudian ditutup menggunakan alumunium foil agar tidak terpapar sinar uv yang dapat merusak senyawa didalamnya dan disimpan dalam deksikator agar tidak lembab dan tahan lama sehingga sampel fraksi etil asetat ekstrak etanolikdaun benalu S. ferruginea (Jack) Danser untuk bisa digunakan pada rentang waktu yang lama. Bobot total fraksi yang diperoleh 1,8567 g dengan rendemen 1,2378%.

F. Hasil Uji Pendahuluan 1. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Uji ini sebagai uji kualitatif yang bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari fraksi etil asetat ekstrak etanol benalu S. ferruginea (Jack) Danser. Uji ini dilakukan dengan mencampurkan antara larutan DPPH dan larutan fraksi lalu

diamati perubahan warnanya. Metode DPPH memiliki prinsip yaitu setiap senyawa yang dapat menangkap radikal bebas DPPH akan terlihat dengan mengamati perubahan warna dari warna ungu menjadi kuning akibat senyawa antioksidan bereaksi dengan DPPH.

Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH dilakukan berdasarkan senyawa antioksidan mampu menghambat radikal bebas dengan mendonorkan atom-atom hidrogen kepada DPPH dan DPPH dikenal sebagai radikal bebas yang stabil pada suhu ruangan. Reaksi DPPH dengan antioksidan akan menetralkan radikal bebas dari DPPH dan membentuk DPPH tereduksi.

Gambar 1. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan

A = DPPH + Metanol;

B = DPPH+Larutan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser+ Metanol;

C = DPPH + Kuersetin + Metanol;

D = Metanol + Larutan Fraksi etil asetat ekstrak etanolik benalu S. ferruginea (Jack) Danser;

Pengujian menggunakan fraksi etil asetat benalu ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser yang dicampur DPPH, telah menunjukkan perubahan warna dari ungu menjadi kuning sehingga dapat disimpulkan bahwa fraksi etil asetat benalu ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser dari inang tanaman T. aurea (Pohon bunga terompet) memiliki aktivitas antioksidan. (Gambar 1)

2. Uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolik

Uji ini merupakan uji kualitatif yang bertujuan untuk mengetahui keberadaansenyawa fenolik dari fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser. Uji ini dilakukan dengan mencampurkan antara larutan fraksi bersama reagen Folin-Ciocalteu dan natrium karbonat. Reagen Folin-Ciocalteu digunakan karena senyawa fenolik dapat bereaksi dengan Folin yang akan membentuk larutan berwarna biru. Senyawa fenolik bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteu hanya dalam suasana basa agar terjadi disosiasi proton pada senyawa menjadi ion fenolat. Menurut Susanti et.al., (2012) untuk membuat kondisi basa digunakan Na2CO3.Folin-Ciocalteu akan mengoksidasi asam fenolat (garam alkali) atau gugus fenolik yang terdapat didalam fraksi daun benalu yang mereduksi asam heteropoli (fosfomolibdat-fosfotungstat) yang terdapat dalam pereaksi Folin-Ciocalteu menjadi suatu kompleks molybdenum-tungsten.

Gambar 2. Hasil Uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolik dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser

A = kontrol positif [asam galat + reagen Folin-Ciocalteu+ Na2CO3 + metanol];

B = larutan uji fraksi + reagen Folin-Ciocalteu + Na2CO3+metanol;

C = Asam galat + Metanol;

D = Larutan blangko [air + metanol + reagen Folin Ciocalteu + Na2CO3] ,

E = Fraksi + metanol.

Pengujian dengan mencampurkan antara larutan fraksi dengan reagen Folin-Ciocalteu dan natrium karbonat menunjukkan warna biru muda sehingga dapat disimpulkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser mengandung senyawa fenolik. Semakin tinggi konsentrasi senyawa fenolik maka semakin banyak ion fenolat yang mereduksi fosfomolibdat-fosfotungstat padareagen Folin-Ciocalteu menjadi kompleks molybdenum-tungsten sehingga warna biru akan semakin pekat. (Gambar 2).

Penggunaan metanol dalam penelitian ini dikarenakan metanol merupakan pelarut yang bersifat universal sehingga dapat melarutkan analit yang bersifat polar dan nonpolar. Metanol dapat menarik alkaloid, steroid, saponin, dan flavonoid dari tanaman (Thompson, 1985).

G. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total

Penentuan kandungan fenolik total bertujuan untuk melihat korelasi antara aktivitas antioksidan dengan kandungan fenolik totalnya karena semakin tinggi kandunagan fenolik maka semakin kuat aktivitas antioksidan.Oleh sebab itu perlu untuk dilakukan penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol total daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser agar dapat diketahui apakah besarnya aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol total daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser sebanding dengan semakin banyak kandungan fenolik total.

1. Penentuan operating time (OT)

Penentuan operating time (OT) pada penetapan kandungan fenolik adalah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil yaitu saat sampel bereaksi sempurna dengan reagen warna. Reagen warna yang digunakan yaitu Folin-Ciocalteu sebagai pereaksi. Sampel yang digunakan yaitu asam galat sebagai sampel pembanding dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik total daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser sebagai sampel uji.

Waktu kerja operating time ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi larutan sampel uji dan pembanding dimana absorbansi dari larutan uji dan pembanding mulai stabil dan selisihnya mulai kecil antara selang waktu yang diujikan. Waktu operating time untuk asam galat selama tiga puluh menit dalam selang lima menit absorbansinya diukur karena dalam rentang waktu 30 menit nilai absorbansi asam galat sudah stabil sedangkan sampel larutan uji fraksi selama 60 menit karena dalam rentang waktu 60 menit larutan uji fraksi

memilik nilai absorbansi yang stabil dan waktu mulai dihitung ketika sampel dicampurkan dengan reagen Folin-Ciocalteu. Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang teoritis 750 nm menurut Julyasih et al., (2005).

Gambar 3. Grafik penentuan OT asam galat (replikasi 2)

Gambar 4. Grafik penentuan OT larutan uji fraksi etil asetat

Hasil yang diperoleh adalah operating time asam galat adalah pada menit ke-20-35 yang cukup diwakilkan dengan replikasi dua sedangkan pada fraksi etil asetat adalah pada menit ke-35-50 (Gambar 4).

0 0.2 0.4 0.6 0.8

0 10 20 30 40

A b so rb a n si Waktu (menit)

Operating time asam galat

51,0 µg/mL 102 µg/mL 153,0 µg/mL 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45

0 20 40 60 80

A b so rb a n si waktu (time)

Penentuan ot larutan uji fraksi etil asetat

Replikasi 1

Replikasi 2

2. Penentuan panjang gelombang maksimum

Tujuan penentuan panjang gelombang maksimum adalah untuk memperoleh daerah serapan maksimum atau absorbansi maksimum antara campuran reagen dengan senyawa fenol. Panjang gelombang maksimum yang didapat akan digunakan pengukuran absorbansi kurva baku asam galat dan uji fenolik total pada laru fraksi S. ferruginea (Jack) Danser.

Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan tiga konsentrasi asam galat 50; 100; dan 150 µg/mL. Tujuan menggunakan tiga konsentrasi ini adalah untuk mempresentasikan panjang gelombang maksimum dan absorbansi maksimum dengan konsentrasi rendah, sendang dan tinggi. Hasil yang diperoleh panjang gelombang maksimum rata-rata antara tiga konsentrasi asam galat yang diuji yaitu 739 nm. (Tabel I).

Tabel I. Hasil scanning panjang gelombang maksimum asam galat yang direaksikan dengan Folin-Ciocalteu

Konsentrasi asam galat (µg/mL)

maksimum hasil scanning

Rata-rata maksimum yang

digunakan

maksimum teoritis

50 739

739 nm 750 nm

100 738,5

150 739,5

H. Estimasi Kandungan Fenolik Total

Estimasi bertujuan untuk mengetahui berapa kadar fenolik total yang terdapat dalam fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu. Untuk mengetahui kadar fenolik

total, dapat menggunakan metode Folin-Ciocalteu. Folin Ciocalteu digunakan sebagai pereaksi pengkompleks warna dimana reaksi yang terjadi antara senyawa uji dan Folin-Ciocalteu yang dapat membentuk kompleks yang stabil berwarna biru jika senyawa uji mengandung senyawa fenol. Semakin pekat warna biru campuran berarti semakin banyak kandungan fenolat yang terdapat dalam larutan senyawa uji.

Menurut Singleton dan Rossi (1965), bahwaprinsip metode Folin-Ciocalteu adalah oksidasi gugus fenolik hidroksil. Pereaksi ini mengoksidasi fenolat (garam alkali), mereduksi asam heteropoli menjadi suatu kompleks molidenum-tungsten (Mo-W). Folin dan Ciocalteu (1944), menyatakan bahwa reagen Folin-Ciocalteu terbuat dari air, natrium tungsten, natrium molibdat, asam fosfat, asam klorida, litium sulfat, dan bromine.

Gambar 5. Kurva baku asam galat dalam penetapan fenolik total (replikasi 3)

Dalam menentukan kurva baku, perlu dilakukan minimal tiga replikasi untuk menentukan mana yang terbaik dari ketiga replikasi dengan memiliki persamaan regresi yang paling linier. Ternyata, dari ketiga replikasi yang memilki persamaan

0 0.2 0.4 0.6 0.8

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

A

b

so

rb

a

n

si

Konsentrasi (µg/ml)

Absorbansi asam galat

y=0,0039x+0, 08601 r = 0,99983

regresi yang paling linier adalah replikasi ke tiga dengan y = 0,0039x + 0,0860 dan r = 0,9998 lebih mendekati angka 1 dibandingkan replikasi lainnya. (Gambar 5).

Tabel II. Hasil penentuan jumlah kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu

Replikasi

Fenolik total

Rata-rata (mg) SD (mg ekuivalen asam

galat)

I 49,74

49,87 0,1838

II 50,00

Berdasarkan perhitungan intrapolasi persamaan regresi linier y = 0,0039x + 0,0834; maka didapatkan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu sebesar 49,87± 0,1838 mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat (Tabel II).

I. Validasi Metode Analisis Penetapan Kandungan Fenolik Total

Tujuan dilakukan validasi metode analisis adalah untuk membuktikan bahwa karakteristik metode analisis memenuhi persyaratan sesuai dengan penggunaannya dan dapat dipercaya. Dalam penetapan kadungan fenolik total ini, parameter yang digunakan untuk validasi metode adalah presisi, dan linearitas.

1. Presisi

Menurut Harmita (2004), presisi (keseksamaan) adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual yang diukur melalui

penyebaran hasil individual dari rata-rata jika produser diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen.

Presisi ditunjukkan dengan besarnya koefesien variansi (CV), semakin kecil CV artinya metode semakin teliti yaitu dibawah 2% (Harmita, 2004).

Tabel III. Nilai presisi seri kurva baku asam galatdalam penetapan kandungan fenolik total

Absorbansi replikasi 1

Absorbansi replikasi 2

Absorbansi replikasi 3

Rerata Absorbansi

SD CV

0,283 0,287 0,291 0,287 0,00400 1,393

0,385 0,385 0,389 0,386 0,00231 0,598

0,470 0,479 0,488 0,479 0,00900 1,8789

0,577 0,576 0,589 0,581 0,01625 1,2451

0,685 0,695 0,696 0,692 0,00608 0,8786

Berdasarkan hasil pengukuran rata-rata SD (standar deviasi) yang diperoleh dari ketiga replikasi yaitu 0,007528 danrerata CV (koefeisen variansi) yang diperoleh adalah 1,19692 (Tabel III). Sehingga dapat disimpulkan presisinya bagus yaitu CVnya dibawah 2 %.

2. Linearitas

Menurut Harmita (2004), linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon secara langsung dengan bantuan transformasi matematika yang baik, dan proposional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Transformasi matematika dalam pengujian linearitas melalui garis lurus dengan metode kuadrat terkecil antara hasil analisis pengukuran dengan konsentrasi analit. Sebagai parameter adanya hubungan linier digunakan koefesien kolerasi r pada analisis regresi linier .

Hubungan linier yang ideal dicapai jika nilai b = 0 dan r = + 1 atau – 1 bergantung pada arah garis sedangkan nilai a menunujukkan kepekaan analisis terutama instrumenyang digunakan.

Berdasarkan hasil pengukuran dan perhitungan, persamaan regresi dari ketiga replikasi yang baik adalah replikasi tiga dengan persamaan y = 0,0039x+0,0860 dengan nilai r yang paling mendekati + 1 atau – 1 yaitu r = 0,99983. (Lampiran 4 dan gambar 5).

J. Hasil optimasi metode uji aktivitas antioksidan 1. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( maks )

Tujuan menentukan panjang gelombang maksimum yaitu untuk memperoleh daerah serapan maksimum dari DPPH supaya mendapat hasil yang lineritas pada kurva baku dalam pengukuran aktivitas antioksidan. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang serapan maksimal. Karena pada panjang gelombang tersebut perubahan serapan untuk setiap satuan konsentrasi adalah paling besar, sehingga akan diperoleh kepekaan analisis yang maksimal. Menurut Suryanto et al (2003), DPPH merupakan senyawa yang memiliki warna violet dengan memiliki panjang gelombang teoritis 515-517 nm.

Penentuan penjang gelombang menggunakan tiga konsentrasi DPPH yang berbeda yaitu konsentrasi 0,020; 0,040, dan 0,06 mM agar dapat mengetahui apakah dengan konsentrasi yang berbeda-beda DPPH memiliki kepekaan yang sama atau tidak. Tetapi dalam pengujiannya mencapai panjang gelombang teoritis dengan nilai

rata-rata 514,67 nm kemudian dibulatkan menjadi 515 nm untuk digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan.(Tabel IV).

Tabel IV. Hasil scanningpanjang gelombang serapan maksimum pada berbagai konsentrasi

Konsentrasi larutan DPPH

maksimum hasil scanning

(nm)

maksimum yang digunakan untuk pengukuran

(nm)

maksimum untuk teoritis (nm)

0,02 mM 514

515 515-517

0,04 mM 515

0,06 mM 515

2. Penentuan operating time (OT)

Tujuan dilakukan operating time adalah untuk mendapat waktu optimum dari reaksi antar larutan pembanding (kuersetin) dan larutan uji (fraksi etil asetat) bereaksi dengan radikal bebas (DPPH) sampai memperoleh absorbansi yang stabil dan selisih absorbansi kecil antara selang waktu lima menit selama satu jam.

Perhitungan waktu dimulai setelah senyawa uji dicampurkan dengan reagen (DPPH) dan absorbansi dihitung setelah lima menit pertama lalu kedua sampai ke dua belas. Pengukuran dilakuakn pada panjang gelmobang maksimum yang didapatkan yaitu 515 nm.

Gambar 6. Grafik penentuan operating time (OT) kuersetin (replikasi 2)

Berdasarkan grafik operating time kuersetin (gambar 6) replikasi dua menunjukkan absorbansi kuersetin mulai stabil atau selisih absorbansi kecil pada rentang waktu 35-45 menit, sehingga pengukuran larutan pembanding kuersetin dapat diukur pada rentang waktu 35-45 menit untuk memperoleh hasil linier. Operating time menggunakan replikasi dua karena grafiknya lebih stabil dan linier dibandingkan replikasi yang lainnya dilihat dari nilai R lebih mendekati angka 1.

Gambar 7. Grafik penentuan operating time fraksi etil asetat (replikasi 2)

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

0 20 40 60 80

A b so rb a n si Waktu (menit)

Penentuan operating time kuersetin

5 µg/ml

10 µg/ml 15 µg/ml 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

A b so rb a n si Waktu (menit)

Penentuan operating time fraksi etil asetat

61,2 µg/ml

66,3 µg/ml

Berdasarkan grafik operating time fraksi etil asetat (gambar 7) pada replikasi kedua menunjukkan absorbansi mulai stabil dan selisih absorbansi mulai kecil pada rentang waktu 25-50menit, sehingga pengukuran fraksi etil asetat menggunakan OT 25 menit. Digunakan dua kali replikasi disebabkan keterbatasan sampel fraksi etil asetat.

K. Estimasi Akitivitas Antioksidan dengan Radikal Bebas DPPH

Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan metode penangkapan radikal bebas DPPH. Akitvitas penangkapan radikal bebas DPPH berdasarkan kemampuan bahan uji dalam mereduksi atau menangkap radikal DPPH yang dapat dilihat dari berkurangnnya warna ungu pada larutan DPPH. Pengurangan intensitas warna larutan DPPH tersebut dihasilkan oleh bereaksinya molekul radikal DPPH dengansatu atom hidrogen yang dilepaskan oleh kompenen bahan uji sehingga terbentuk senyawa yang berwarna kuning. Menurut Nurani (2013), berkurangnya intensitas warna ungu dari larutan DPPH menunjukkan potensi fraksi etil asetat dalam menangkap radikal DPPH. Semakin besar konsentrasi larutan bahan uji maka absorbansi yang dihasilkan semakin kecil, berarti aktivitasnya sebagai penangkap radikal bebas semakin besar. Kovela et.al., (2002), menyatakan metode DPPH merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitive untuk pengujian aktivitas antioksdan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman.

Penentuan nilai aktivitas antioksidan menggunakan perhitungan nilai IC50 yaitu konsentrasi (µg/ml) tertentu yang dapat memberikan 50% efek penghambatan atau meredam radikal bebas yang dibandingkan dengan kontrol melalui suatu

persamaan garis linier. Nilai IC50 diperoleh dari perpotongan garis antara daya

hambatan dan sumbu konsentrasi, kemudian dimasukan ke dalam persamaan y = a + bx, dengan y = 50 dan nilai x menunjukan IC50. Menurut Molyneux (2004), ekstrak dinyatakan sebagai antioksidan bila nilai IC50 kurang dari 200 µg/ml. Daya hambat terhadap radikal bebas DPPH diukur secara spektrofotometri Uv-vis berdasarkan perubahan warna yang terjadi.

Penggunaan kuersetin sebagai pembanding karena kuersetin merupakan golongan flavonoid yang bersifat sebagai antioksidan (Syofyan et al, 2008) dan terkandung dalam benalu S. ferruginea (Jack) Danser serta larut dalam pelarut metanol. Dalam penelitian ini kuersetin bertujuan untuk melihat apakah potensi aktivitas antioksidan fraksi etil asetat lebih kuat atau tidak jika dibandingkan dengan kuersetin. Hasil dalam penelitian menunjukkan bahwa pembanding kuersetin lebih kuat antioksidannya dibandingkan fraksi etil asetat ekstrak daun benalu.

Menurut Lukman cit Resi dan Sugarni (2009), menyatakan kuersetin sendiri adalah senyawa kelompok flavonol terbesar, kuersetin dan glikosidanya berada dalam jumlah sekitar 60-75% dari flavonoid. Ketika flavonoid kuersetin bereaksi dengan radikal bebas, kuersetin mendonorkan protonnya dan menjadi senyawa radikal, tapi elektron tidak berpasangan yang dihasilkan didelokaslisasi oleh resonansi, hal ini membuat senyawa kuersetin radikal memiliki energi yang sangat rendah untuk menjadi radikal yang reaktif. Kuesetin diperoleh dari berbagai sumber yaitu apel, gandum, bawang, dan buah jeruk. Kuersetin juga dikenal sebagai antioksidan yang kuat dalam uji DPPH.

V1 X C1 = V2 X C2 6 mL X 100 µg/mL = 10 mL X C2

C2 = 60 µg/mL

Replikasi Konsentrasi Absorbansi kontrol

Absorbansi

fraksi % IC

Persamaan regresi linier (µg/mL) 1 60 0,89

0,447 49,77 y=0,1988,x+37,796

62,5 0,443 50,22 r = 0,9908

65 0,44 50,56

67,5 0,433 51,35

70 0,43 51,69

Replikasi Konsentrasi Absorbansi kontrol

Absorbansi

fraksi % IC

Persamaan regresi linier (µg/mL)

61,2

0,885

0,437 50,62 y=0,1855x+39,2460

63,75 0,433 51,07 r=0,9985

2 66,3 0,429 51,52

68,95 0,425 51,98

71,4 0,42 52,54

Replikasi Konsentrasi Absorbansi kontrol

Absorbansi

fraksi % IC

Persamaan regresi linier (µg/mL)

60,6

0,88

0,441 49,89 y=0,2606x+34,098

63,125 0,435 50,57 r = 0,9988

3 65,65 0,43 51,14

68,175 0,423 51,93

70,7 0,418 52,5

Contoh hitungan % IC replikasi 1

% IC konsentrasi 60 µg/mL =

x

100 % = 49,77% % IC konsentrasi 62,5 µg/mL =

x

100 % =50,22%

% IC konsentrasi 65 µg/mL =

x

100 % = 50,56% % IC konsentrasi 67,5µg/mL =

x

100 % = 51,35% % IC konsentrasi 70 µg/mL =

x

100 % =51,69%

3. Perhitungan nilai IC50 fraksi etil asetat ekstrak etanolik benalu Scurrula

ferruginea

Fraksi etil asetat ekstrak etanolik benalu Scurrula ferruginea Replikasi 1

Persamaan regresi linier: y=0,1988,x+37,796

(y = aktivitas antioksidan, x = kadar fraksi dalam µg/mL) IC50 adalah nilai x saat y = 50

50 = ,1988,x+37,796

x = = 61,39 µg/mL

Replikasi Persamaan IC50

I y =0,1988,x+37,796 61,39 µg/mL

II y =0,1855x+39,2460 57,97µg/mL

4. Penentuan Operating time fraksi etil asetat

Waktu (menit)

Absorbansi OT fraksi Replikasi 1 pada panjang gelombang 515 nm

60, µg/ml 65 µg/ml 70 µg/ml

5 0,494 0,449 0,426

10 0,483 0,432 0,436

15 0,478 0,422 0,493

20 0,475 0,415 0,485

25 0,474 0,410 0,480

30 0,473 0,408 0,477

35 0,472 0,405 0,478

40 0,474 0,404 0,476

45 0,474 0,404 0,476

50 0,476 0,406 0,477

55 0,480 0,407 0,478

60 0,481 0,409 0,478

Waktu (menit)

Absorbansi OT fraksi Replikasi 2 pada panjang gelombang 515 nm

61,2 µg/ml 66,3 µg/ml 71,4 µg/ml

5 0,436 0.437 0,422

10 0,435 0.434 0,420

15 0,434 0.432 0,429

20 0,434 0.430 0,425

25 0,437 0.422 0,423

30 0,437 0.423 0,423

35 0,439 0.423 0,423

40 0,438 0.424 0,422

45 0,438 0.423 0,421

50 0,440 0.422 0,420

55 0,439 0.418 0,418

60 0,438 0.414 0,416

Waktu (menit)

Absorbansi OT fraksi Replikasi 3 pada panjang gelombang 515 nm

60,6 µg/ml 65,65 µg/ml 70,7 µg/ml

5 0,488 0,475 0,465

10 0,485 0,474 0,464

15 0,485 0,475 0,464

20 0,483 0,470 0,462

25 0,480 0,462 0,463

30 0,480 0,461 0,460

35 0,479 0,460 0,459

40 0,477 0,462 0,457

45 0,477 0,462 0,456

50 0,475 0,461 0,452

55 0,473 0,458 0,451

60 0,467 0,459 0,444

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakn Metode Radikal 1,1-Difenil -2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan Kadar Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Daun Benalu Scurrula ferruginea (Jack) Danser Pada Tanaman Tabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore” memiliki nama lengkap Yonathan Pura Hama Nganggu. Dilahirkan di kota Waingapu, Kabupaten Sumba Timur, Nusa Tenggara Timur, pada tanggal 19 Januari 1993 dari pasangan Hama Nganggu dan Yohana Olindima. Penulis telah menyelesaikan pendidikan di TK Payeti Waingapu pada tahun 1997 hingga 1999 lalu melanjutkan pendidikan dasar di SD Negeri Inpres Oetete 3 Kota Kupang pada tahun 1999 hingga 2005. Penulis melanjutkan pendidikan menengah di SMPN 2 Kota Kupang pada tahun 2005 hingga 2008 dan SMAN 3 Kota Kupang pada tahun 2008 hingga 2011. Kemudian penulis melanjutkan pendidikan perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2011 hingga 2016. Selama menjadi mahasisiwa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, penulis cukup aktif dalam kegiatan kemahasiswaan, kepanitiaan dan kegiatan lain yang terdapat di dalam maupun diluar Universitas Sanata Dharma antara lain; dalam UKF sepak bola Squadra (2011-2013); panitia Titrasi (2013); dan panitia Pelaksanaan Aksi Hari Kesehatan dan Lingkungan Hidup.