III. METODOLOGI
A. ALAT
Peralatan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah inkubator shaker orbital incubator SI 50, Stuart Scientific, laminar flow, sentrifuse
micro TOMMY, spectrofotometer U-2010, autoclaf Hirayama. Alat lainnya yang digunakan antara lain micropipette, Vortex mixer, gelas piala,
tabung reaksi, tabung ulir, neraca analitik Precisa, pipet, pH meter, holder milipore dan milipore 0,22
μm.
B. BAHAN
Media pertumbuhan bakteri yang digunakan adalah MRS De Man Rogrosa and Sharpe broth Oxoid, MRS agar Oxoid, yeast extrac Difco,
Muller Hinton Agar Oxoid dan Nutrient agar serta Nutrient broth Oxoid. Bahan kimia yang digunakan adalah NaCl pa, NaOH pa dan HCl pa 32
MERCK.
C. MIKROORGANISME
Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri asam laktat BAL galur SCG 1223 yang digunakan sebagai produsen bakteriosin. Isolat
tersebut merupakan koleksi dari laboratorium bakteriologi Balai Besar Sumberdaya Genetika, yang merupakan hasil isolasi dari produk peternakan
yang diambil di wilayah Bogor. Bakteri indikator yang digunakan adalah Listeria monocytogenes
bakteri gram positif, Salmonella thyphimurium, Escherchia coli
bakteri gram negatif merupakan koleksi labolatorium Enterobactericeae
Balai Besar Penelitian Veteriner Bogor.
D. METODA PENELITIAN
Penelitian yang dilakukan terdiri dari dua tahap yaitu penelitian tahap. Penelitian tahap pertama bertujuan untuk peremajaan isolat dan memperoleh
fase pertumbuhan bakteri. Pada penelitian tahap kedua menumbuhkan bakteri
terpilih pada media MRS broth dengan berbagai pengaruh pH, suhu, waktu serta persentase inokulum.
1. Penelitian Tahap Pertama
a. Peremajaan Biakan dan Persiapan Inokulum
Isolat BAL yang digunakan dalam bentuk kultur stok pada agar miring. Sebelum digunakan isolat harus diremajakan atau diaktifkan
terlebih dahulu. Untuk meremajakan kultur stok sebanyak 1 ose kutur bakteri ditumbuhkan pada 10 ml MRS broth yang diinkubasi pada
suhu 37ºC selama 24 jam dilakukan beberapa kali dan dengan penambahan yeast extract hingga bakteri yang digunakan tumbuh
dengan baik. Peremajaan bakteri juga dilakukan pada bakteri indikator dengan menggunakan media nutrien agar. Diagram alir proses
peremajaan bakteri disajikan pada Lampiran 1.
b. Kurva Pertumbuhan Bakteri
Tahap ini bertujuan untuk mengetahui kurva pertumbuhan bakteri SCG 1223 dan fase pertumbuhannya. Kurva pertumbuhan
bakteri dilakukan selama 20 jam inkubasi dan untuk mengetahui fase- fase yang ada dilakukan sampling setiap 1 jam. Fase-fase yang
terbentuk akan berguna untuk menentukan waktu generasi bakteri, khususnya fase eksponensial yang erat hubungannya dengan sekresi
substansi antimikroba. Sebanyak 5 dari kultur segar ditanam dalam MRS broth
dan diinkubasi pada suhu 37ºC. pertumbuhan bakteri diikuti setiap jam dengan mengamati nilai kerapatan optik atau optical density OD dari
starter pada media MRS dengan metode turbidimetrik dengan panjang gelombang 620 nm Hadioetomo, 1990.
2. Penelitian Tahap Kedua
a. Perlakuan
Pada penelitian ini dilakukan produksi bakteriosin dengan perlakuan persentase inokulum, suhu, pH awal media dan waktu
inkubasi. Persentase inokulum yang digunakan sebesar 5 dan 10 , pH media yang digunakan pH 4 dan pH 6, suhu 27ºC dan 40ºC,
sedangkan waktu inkubasi yang digunakan selama 4 jam, 10 jam dan 14 jam.
b. Produksi Bakteriosin
Tahap penelitian ini bertujuan untuk menghasilkan bakteriosin yang merupkan protein yang memiliki aktifitas paling tinggi terhadap
bakteri indikator. Produksi bakteriosin menggunakan erlenmeyer 1000 ml dengan volume kerja working volume 400 ml. Sebelum produksi
bakteriosin dilakukan, terlebih dahulu dibuat medium propagasi. Kultur hasil propagasi diinokulasi pada media MRS broth yang di beri
perlakuan pH awal 4 dan 6 dengan persentase inokulum 5 vv dan 10 vv. Lalu inkubasi selama 4 sampai 14 jam dengan suhu 27ºC
dan 40ºC. Selanjutnya kultur hasil produksi yang diperoleh disentrifugasi pada 10.000 rpm, 4
˚C selama 15 menit sehingga menghasilkan supernatan. Supernatan dibagi menjadi dua. Yang
pertama supernatan disaring dengan menggunakan milipore 0,22 μm
untuk menghasilkan supernatan bebas sel. Kedua, supernatan dinetralkan pH nya dengan menggunakan NaOH untuk menghilangkan
pengaruh asam yang dihasilkan. Selanjutnya, supernatan bebas sel dan supernatan netral bebas sel diuji aktivitas dengan metode sumur agar
Delgado et al., 2001. Diagram alir produksi bakteriosin dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Diagram Alir Produksi Bakteriosin
3. Uji Aktivitas Bakteriosin
Bakteri indikator diremajakan pada cawan agar lalu diinkubasi pada 37ºC selama 24 jam. Setelah inokulum berumur 24 jam, koloni di
pindahkan dalam 5 ml garam fisiologis lalu dibandingkan kekeruhannya dengan Mcfarland No. 3 dengan OD 0,755 atau setara dengan kekeruhan
10
9
inokulum bakteri. Setelah didapatkan suspensi bakteri indikator, dilakukan pengenceran hingga 10
6
. Suspensi bakteri indikator yang diperoleh diinokulasi sebanyak 1 ml kedalam cawan agar berisi media
muller hinton agar setelah media cairan inokulum berdifusi dibuat sumur dengan diameter 6 mm dengan mengunakan alat sumuran.
Sampel yang akan diuji, diambil sebanyak 50 μl dan dimasukkan
kedalam sumur pada media uji dan dibiarkan selama bebeapa menit pada suhu kamar, kemudian di inkubasi 37ºC selama 24 jam dan diamati
aktivitasnya. Aktivitas hambatan supernatan terhadap bakteri indikator akan terlihat dengan munculnya zona bening disekitar sumur. Unit
aktivitas bakteriosin di definisikan sebagai AU Activity Unit, 1 AU merupakan luas daerah hambatan per satuan volum contoh bakteriosin
yang diuji mm
2
mL. Aktivitas bakteriosin dapat dihitung dengan menggunakan
persamaan berikut : Aktivitas bakteriosin mm
2
mL =
Lz - Ls V
Lz : Luas zona bening mm
2
. Ls : Luas sumur mm
2
. V : Volume contoh ml.
4. Rancangan perlakuan
Pada penelitian tahap dua terdiri dari empat faktor yaitu faktor persentase inokulum yang terdiri dari dua taraf yaitu 5 dan 10; faktor
pH media terdiri dari dua faktor yaitu pH 4 dan pH 6; faktor suhu yaitu 27ºC dan 40ºC; faktor waktu inkubasi terdiri dari tiga taraf yaitu 4 jam, 10
jam dan 14 jam. Rancangan produksi antibaktgeri dalam penelitian ini secara lengkap disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2. Tabel rancangan produksi antibakteri Kode
Run Inokulum
pH Suhu ºC
Waktu Jam 1
5 4 27 4
2 5 6
27 4 3
5 4 40 4
4 5 6
40 4 5
5 4 27 10
6 5 6
27 10 7
5 4 40 10
8 5 6
40 10 9
5 4 27 14
10 5 6
27 14 11
5 4 40 14
12 5 6
40 14 13
10 4 27 4
14 10 6
27 4 15
10 4 40 4
16 10 6
40 4 17
10 4 27 10
18 10 6
27 10 19
10 4 40 10
20 10 6
40 10 21
10 4 27 14
22 10 6
27 14 23
10 4 40 14
24 10 6
40 14
VI. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. FASE PERTUMBUHAN BAKTERI ASAM LAKTAT SCG 1223
Fase pertumbuhan bakteri asam laktat SCG 1223 digunakan untuk menentukan waktu inkubasi selama produksi senyawa antibakteri. Grafik
pertumbuhan bakteri asam laktat SCG 1223 dapat dilihat pada Gambar 5.
0.000 0.500
1.000 1.500
2.000 2.500
3.000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Jam OD
1.00E+00 1.00E+01
1.00E+02 1.00E+03
1.00E+04 1.00E+05
1.00E+06 1.00E+07
1.00E+08 1.00E+09
1.00E+10 1.00E+11
1.00E+12 1.00E+13
TP C
OD TPC
I : Fase lag II : Fase eksponensial
III : Fase Stasioner IV : Fase kemastian
Gambar 5. Grafik pertumbuhan Bakteri asam laktat galur SCG 1223
Fase pertumbuhan bakteri asam laktat BAL galur SCG 1223 terdiri dari fase lag, fase eksponensial, fase stasioner dan fase kematian. Pada fase lag
bakteri melakukan proses aklimatisasi terhadap kondisi lingkungannya seperti pH, suhu, nutrisi dan lain sebagainya, pada fase ini peningkatan jumlah sel
bakteri berlangsung lambat. Pada fase lag pada bakteri asam laktat SCG 1223 terjadi selama jam ke-0 sampai jam ke-3. Fase kedua adalah fase eksponensial
yang merupakan fase dimana pertumbuhan bakteri berlangsung sangat cepat. Pada pertumbuhan bakteri BAL galur SCG 1223 fase eksponensial terjadi
pada jam ke-4 sampai jam ke-10. Fase berikutnya adalah fase stasioner, pada II III
IV I
fase ini tidak terjadi penambahan jumlah bakteri karena jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati. Pada pertumbuhan bakteri asam
laktat galur SCG 1223 fase stasioner ini terjadi mulai jam ke-11 hingga jam ke-14. Fase terakhir adalah fase kematian, fase kematian pada pertumbuhan
bakteri SCG 1223 terjadi mulai jam ke-15 pada fase ini jumlah sel bakteri mulai menurun karena nutrien dalam media dan cadangan energi dalam sel
mulai menipis. Bakteriosin merupakan substansi antibakteri yang disintesis langsung
di ribosom selama pertumbuhan bakteri asam laktat, produksi maksimum terjadi pada fase eksponensial sampai awal fase stasioner. Menurut Jimenez
Diaz 1993 produksi bakteriosin terbaik pada saat mencapai akhir fase eksponensial atau awal fase stasioner.
Antibiotik yang diproduksi oleh bakteri merupakan metabolit sekunder yang disintesis selama fase stasioner dalam pertumbuhan bakteri.
Bakteriosin merupakan antibakteri yang diproduksi mengikuti pola metabolit primer. Bakteriosin diproduksi selama fase stsioner dalam pertumbuhan
bakteri asam laktat seperti Plantaricin F, Pediocin N5p, Plantaricin. Pada produksi bakteriosin Pediocon PD-1 disintesis selama fase eksponensial dan
dicapai produksi maksimum pada fase stasioner Navaro et al., 2000.
B. AKTIFITAS HAMBAT ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT 1223
Kategori