dengan rotary evaporator dan dipekatkan diatas penangas air hingga didapatkan fraksi kental kloroform. Ampas II dimaserasi dengan etanol 96 kurang lebih 3 hari dengan
shaker dan ditutup dengan alumunium foil. Saring dengan corong Buchner hingga
didapat filtrat etanol dan ampas III disisihkan. Filtrat etanol diuapkan dengan rotary evaporator
dan dipekatkan di atas penangas air hingga didapatkan fraksi etanol.
5. Pengujian potensi antimikroba
a. Penyiapan stok mikroba uji
Diambil dari kultur mikroba simpanan menggunakan jarum ose steril sebanyak 1 hingga 2 koloni tunggal. Diinokulasikan pada 5 mL Nutrien Agar miring
dan diinkubasi selama 24 jam dan pada suhu 37 C.
b. Pembuatan suspensi mikroba uji
Pembuatan suspensi mikroba dilakukan dengan mengambil 1-2 ose mikroba dari stok yang telah dibuat sebelumnya, diinokulasikan pada 5 mL media Nutrien
Broth, suspensi tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C, kemudian
divortex, diambil 1 mL suspensi tersebut ditambah NB dan disetarakan kekeruhannya dengan larutan standar Mc. Farland II 6 x10
8
CFUmL menggunakan alat Densicheck.
c. Pembuatan variasi konsentrasi larutan uji
Larutan yang digunakan untuk uji antimikroba didapatkan dengan melarutkan fraksi petroleum eter, kloroform, etanol dengan DMSO. Fraksi masing-
masing dibuat dalam berbagai variasi konsentrasi 50 bv ; 25 bv ; 12,5 bv ; 6,25 bv dan 3,125 bv.
Pembuatan masing-masing fraksi dengan konsentrasi 50 stok larutan uji dibuat dengan cara ekstrak kental hasil penyarian yang diperoleh ditimbang
sejumlah 5 g yang kemudian dilarutkan ke dalam 10 mL DMSO untuk masing- masing fraksi. Stok larutan uji yang dibuat, dapat dibuat variasi konsentrasi larutan
uji sebagai berikut:
Tabel I . Pembuatan variasi konsentrasi uji
d. Uji potensi antimikroba
1 Pembiakan suspensi bakteri dan fungi secara pour plate.
Mula-mula dari suspensi mikroba uji diambil sebanyak 0,2 mL, diinokulasikan kedalam 20 mL media NA dalam tabung reaksi dan divortex. NA
yang telah bercampur dengan suspensi tersebut dituang kedalam petri steril kemudian digoyang-goyang dan biarkan memadat.
2 Uji potensi antimikroba dilakukan dengan metode difusi sumuran
Larutan uji dibuat variasi konsentrasi 50 bv; 25bv; 12,5bv; 6,25bv dan 3,125bv. Setelah pembiakan suspensi bakteri secara pour
Konsentrasi Larutan Uji bv
Volume yang diambil dari stok larutan uji mL
Di add dengan DMSO sampai mL
25 5,0
10 12,5
5,0 10
6,25 5,0
10 3,125
5,0 10
plate , dibuat sumuran dengan menggunakan pelubang sumuran no.4
berdiameter 8 mm sebanyak 7 sumuran. Tiap lubang sumuran masing-masing ditambal dengan 50 µL setelah memadat kemudian diisi 50 µL dengan fraksi
petroleum eter, kloroform, dan etanol yang berkonsentrasi 50 bv; 25 bv; 12,5 bv; 6,25 bv dan 3,125 bv. Amoksisilin 0,0005 mgmL sebagai
kontrol positif untuk Staphylococcus aureus, Escherechia coli dan Ketoconazole 0,1 gmL untuk Candida albicans. DMSO sebagai kontrol negatif dari fraksi
petroleum, kloroform dan etanol. Petri-petri tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
C kemudian diamati ada tidaknya zona hambat disekitar sumuran. Zona hambat yang terbentuk diukur dengan penggaris. Pada uji potensi
antimikroba ini direplikasi sebanyak 3 kali untuk masing-masing fraksi. e.
Pengukuran KHM dengan metode dilusi padat Uji potensi antimikroba pada metode difusi didapatkan konsentrasi
terkecil dari fraksi petroleum eter, kloroform, dan etanol yang dapat menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus, Escherechia coli, dan Candida albicans.
Konsentrasi terkecil tersebut dibuat rentang konsentrasi yang lebih rendah sebanyak variasi konsentrasi untuk mengetahui besarnya kadar hambat minimal dari masing-
masing fraksi. Fraksi petroleum eter, kloroform, dan etanol dibuat variasi konsentrasi, mula-mula pengujian dilakukan dengan membuat suspensi bakteri yang
disetarakan kekeruhannya dengan larutan standar Mc. Farland II 6 x 10
8
CFUmL menggunakan alat Densicheck. Suspensi tersebut diambil 0,5 mL, ditambah dengan
kadar tertentu dan dicampur rata dengan 30 mL media. Setelah itu dituang dalam
cawan petri dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C. Diamati banyak sedikit
atau ada tidaknya pertumbuhan bakteri uji pada berbagai variasi konsentrasi dengan ditandai suatu notasi tertentu. Larutan uji untuk fraksi petroleum eter, kloroform,
dan etanol dibuat masing-masing dengan cara yang sama.
6. Identifikasi kandungan senyawa bunga pulu dengan uji tabung.
