Jenis dan Rancangan Penelitian Bahan Penelitian Alat Penelitian Analisis Data

25

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk dalam jenis penelitian eksperimental murni dengan menggunakan rancangan acak lengkap pola satu arah. Kemudian dianalisis statistik uji normalitas Shapiro-Wilk yang dilanjutkan dengan uji Kruskal-Wallis serta uji Wilcoxon. Selain itu, dilakukan juga analisis eksploratif- deskriptif untuk menentukan KHM dan KBM serta identifikasi komponen minyak atsiri serai wangi Jawa menggunakan GC-MS.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel penelitian

a. Variabel bebas. Variabel bebas yang terdapat dalam penelitian ini adalah konsentrasi uji daya antibakteri minyak atsiri daun serai wangi Jawa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. b. Variabel tergantung. Variabel tergantung yang terdapat dalam penelitian ini adalah diameter zona hambat pertumbuhan bakteri Porphyromonas gingivalis . c. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali yang terdapat dalam penelitian ini adalah media pertumbuhan bakteri, suhu inkubasi 37 o C, lama inkubasi 48 jam, diameter sumuran 6 mm, kepadatan suspensi bakteri uji setara dengan larutan standar Mc Farland II 6.10 8 CFUmL, dan volume pemberian minyak atsiri. d. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali yang terdapat dalam penelitian ini adalah proses destilasi minyak atsiri serai wangi Jawa, tanaman serai wangi yang digunakan untuk destilasi, teknik destilasi minyak atsiri serai wangi Jawa.

2. Definisi operasional

a. Minyak atsiri adalah kelompok minyak nabati yang berwujud cairan kental, mudah menguap pada suhu ruangan dan memiliki bau khas. b. Minyak atsiri serai wangi Jawa Citronella Java Oil adalah minyak atsiri yang diperoleh dari tanaman serai wangi yang dibeli dari CV. Indaroma dengan nomor batch ’12 09 F027. c. Porphyromonas gingivalis adalah biakan bakteri dengan ATCC 33277 yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta dan bakteri ini merupakan gram negatif, anaerob, tidak memiliki alat gerak atau coccobacilli dan panjangnya 0,5 –2 µm, dapat menyebabkan penyakit gingivitis. d. Daya antibakteri adalah kekuatan minyak atsiri serai wangi Jawa untuk dapat menghambat atau membunuh bakteri Porphyromonas gingivalis. e. Metode difusi sumuran adalah suatu cara untuk mengetahui aktifitas daya antibakteri larutan uji terhadap bakteri uji dengan cara melubangi media padat yang telah diinokulasi dengan bakteri. f. Metode dilusi padat adalah suatu cara yang digunakan untuk menentukan KHM serta KBM terhadap bakteri Porphyromonas gingivalis. g. KHM adalah konsentrasi terkecil yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Porphyromonas gingivalis. h. KBM adalah konsentrasi terkecil yang dapat membunuh bakteri Porphyromonas gingivalis.

C. Bahan Penelitian

Bahan penelitian yang digunakan yaitu minyak atsiri serai wangi Jawa Citronella Java Oil yang diperoleh dari CV. Indaroma dengan nomor batch ’12 09 F027, larutan standar Mc Farland II, bakteri Porphyromonas gingivalis ATCC 33277, aquadest, Trypticase Soya Agar TSA Oxoid, NaCl 0,9, Klorheksidin Minosep® sebagai kontrol positif, dan parafin cair sebagai kontrol negatif.

D. Alat Penelitian

Microbiological Safety Cabinet , oven, piknometer, hand refractometer Atago, autoklaf, inkubator CO 2 Barnstead Lab-Line, vortex, densichek Vitek, alat-alat gelas Pyrex, jarum ose, stirrer, hotplate, neraca analitik, mikropipet, pelubang sumuran 6 mm, GCMS-QP2010S Shimadzu, kolom Rastek stabilwak R-DA, kamera.

E. Tata Cara Penelitian

1. Karakterisasi minyak atsiri serai wangi Jawa Citronella Java Oil

a. Pemeriksaan organoleptis. Pemeriksaan organoleptis yaitu meliputi pemeriksaan warna dan bentuk minyak atsiri. b. Pengukuran nilai bobot jenis minyak atsiri. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan piknometer. Piknometer dibersihkan dengan menggunakan etanol 70 dan kemudian dikeringkan dengan diberi udara kering. Bagian luar piknometer diseka dengan kain kering. Piknometer didiamkan selama 30 menit lalu ditimbang. Kemudian piknometer diisi dengan menggunakan air suling suhu 25 o C, lalu mengkondisikannya pada suhu ± 0,2 o C dibawah 25 o C selama 30 menit. Selanjutnya dibiarkan selama 30 menit lagi hingga suhu 30 o C dan timbang. Hasil timbangan dicatat. Piknometer kemudian dikosongkan dan dicuci dengan etanol 70 lalu dikeringkan dengan diberi udara kering. Kemudian diisi dengan minyak atsiri yang bersuhu 25 o C dan mengkondisikannya pada suhu ± 0,2 o C dibawah 25 o C selama 30 menit. Dibiarkan selama 30 menit lagi hingga suhu 30 o C. Lalu piknometer ditimbang. Menghitung bobot jenis minyak atsiri serai wangi. Dilakukan sebanyak tiga kali replikasi. c. Pengukuran indeks bias minyak atsiri. Pengukuran dengan menggunakan alat hand refractometer. Skala diatur 1, 2, atau 3, jarak jangkau dari skala itu yaitu : “1” :1,333-1,404 skala sebelah kiri; “2” : 1,404-1,468 skala tengah; “3” : 1,468-1,520 skala sebelah kanan. Ujung refraktometer setelah prisma ditetesi dengan minyak atsiri diarahkan ke cahaya dan dilihat melalui lensa dengan memutar skala sampai terlihat garis batas gelap dan terang dengan jelas. Kalibrasi yang ditunjukkan oleh garis batas tersebut memperlihatkan nilai dari indeks bias.

2. Uji daya antibakteri minyak atsiri serai wangi Jawa Citronella Java Oil

terhadap Porphyromonas gingivalis dengan metode difusi sumuran Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta. Uji daya antibakteri minyak atsiri serai wangi dengan metode sumuran dilakukan dengan tahap-tahap sebagai berikut : a. Pembuatan larutan uji. Minyak atsiri serai wangi Jawa Citronella Java Oil dibuat berbagai variasi pengenceran dengan cara dilarutkan dalam parafin cair. Variasi konsentrasi pengenceran yaitu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 dan 10. b. Pembuatan stok bakteri. Diambil 1-3 ose dari bakteri Porphyromonas gingivalis yang telah dibiakkan, kemudian diinokulasikan pada TSA yang sudah berada di cawan petri secara streak plate dan diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 37 o C di inkubator CO 2 . Tahap ini digunakan sebagai stok bakteri untuk tahap selanjutnya. c. Pembuatan suspensi bakteri. Diambil 1-3 ose stok bakteri Porphyromonas gingivalis , diinokulasikan ke dalam 5 mL NaCl 0,9 dan divortex supaya tercampur homogen lalu ditunggu selama beberapa saat. Setelah itu suspensi bakteri uji disetarakan dengan larutan standar Mc Farland II 6.10 8 CFUmL atau diukur dengan menggunakan alat densichek hingga konsentrasinya sama dengan larutan standar Mc Farland II. d. Pembuatan kontrol media. Media TSA dituang ke dalam cawan petri dan dibiarkan memadat, kemudian diinkubasi di inkubator CO 2 pada suhu 37 o C selama 48 jam. Setelah itu, diamati apakah terdapat bakteri yang tumbuh atau tidak. e. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji. Media TSA yang telah bersuhu 45-55 o C setelah disterilkan, kemudian ditambahkan suspensi bakteri uji Porphyromonas gingivalis dengan kepadatan sesuai dengan standar Mc Farland II lalu dituang ke dalam cawan petri dan digoyang supaya bakteri tersebar merata. Kemudian diinkubasi pada inkubator CO 2 dengan suhu 37 o C selama 48 jam. Setelah itu, diamati pertumbuhan bakteri dan dibandingkan dengan perlakuan. f. Uji daya antibakteri minyak atsiri serai wangi Jawa terhadap Prophyromonas gingivalis dengan difusi sumuran. 30 mL TSA yang telah disiapkan kemudian ditambahkan 1 mL suspensi bakteri, lalu dituang ke dalam cawan petri secara pour plate, digoyang, dan dibiarkan memadat. Setelah memadat, media tersebut dilubangi hingga dasar cawan petri menggunakan pelubang sumuran 6 mm. Lubang tersebut kemudian diberi 30 µL media dan dibiarkan hingga memadat. Lalu lubang-lubang sumuran ini diisi dengan berbagai variasi konsentrasi, kontrol negatif parafin cair, dan kontrol positif klorheksidin 0,2 dengan volume masing-masing sebanyak 50 µL. Kemudian diinkubasikan pada inkubator CO 2 dengan suhu 37 o C selama 48 jam lalu diamati dan diukur zona jernih yang dihasilkan.

3. Penentuan KHM dan KBM minyak atsiri serai wangi Jawa Citronella

Java Oil terhadap Porphyromonas gingivalis dengan metode dilusi padat Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta. Penentuan KHM dan KBM minyak atsiri serai wangi Jawa dengan metode dilusi padat dilakukan dengan tahap-tahap sebagai berikut : a. Uji daya antibakteri dengan dilusi padat. Diambil 1 mL larutan uji kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri secara bersamaan dengan TSA yang telah ditambah dengan suspensi bakteri secara pour plate. Kemudian cawan petri digoyang hingga larutan uji merata di seluruh bagian media. Perlu juga dilakukan pembuatan kontrol negatif, kontrol positif, kontrol tumbuh, dan kontrol media sebagai pembanding. Pembuatan kontrol media yaitu dengan menuang media TSA tanpa ada suspensi bakteri secara pour plate di cawan petri. Pembuatan kontrol tumbuh yaitu dengan menuang media TSA yang telah diberi tambahan suspensi bakteri secara pour plate di cawan petri. Pembuatan kontrol positif yaitu dengan menuang 1 mL kontrol positif klorheksidin 0,2 bersama dengan media TSA yang telah diberi tambahan suspensi bakteri secara pour plate di cawan petri. Pembuatan kontrol negatif yaitu dengan menuang 1 mL parafin cair bersama dengan media TSA yang telah diberi tambahan suspensi bakteri secara pour plate di cawan petri. Kemudian semuanya diinkubasi pada inkubator CO 2 dengan suhu 37 o C selama 48 jam dan dibandingkan kekeruhannya dengan kekeruhan kontrol pertumbuhan. Semakin keruh maka diberi tanda + lebih banyak dibandingkan dengan yang jernih. b. Penentuan nilai KHM dan KBM. Penentuan nilai KHM dan KBM dilakukan dengan melakukan streak plate dari hasil uji daya antibakteri secara dilusi padat. Hasil uji yang digunakan adalah semua media yang memberikan kejernihan media secara visual. Konsentrasi terendah hasil streak plate yang sudah tidak menunjukkan pertumbuhan bakteri maka ditentukan sebagai KBM, dan konsentrasi terkecil yang dapat menghambat bakteri ditandai dengan bakteri masih dapat tumbuh pada hasil streak plate ditentukan sebagai KHM.

4. Identifikasi komponen minyak atsiri serai wangi Jawa Citronella Java

Oil menggunakan GC-MS Identifikasi minyak atsiri serai wangi dilakukan Jawa di Laboratorium Kimia Organik FMIPA UGM Yogyakarta dengan menggunakan GC-MS - QP2010S Shimadzu. Minyak atsiri serai wangi tanpa menggunakan pelarut dianalisis secara GC-MS dengan kondisi analisis yaitu jenis kolom Rastek stabilwak R-DA dengan diameter 0,25 mm dan panjang 30 meter, suhu injektor 215 o C, gas pembawa helium, kecepatan alir fase gerak 0,9 mLmenit, dan tekanan 49,5 kPa. Suhu kolom diprogram 60 o C selama 5 menit kemudian dinaikkan perlahan-lahan dengan kecepatan 4 o Cmenit hingga suhu mencapai 215 o C dan ditahan selama 30 menit. Identifikasi komponen-komponen minyak atsiri serai wangi yaitu dengan cara membandingkan spektrum massa sampel dengan spektrum massa yang terdapat dalam data library yang memiliki tingkat kemiripan yang paling tinggi.

F. Analisis Data

Minyak atsiri serai wangi Jawa yang telah dilakukan uji daya antimikroba dengan metode difusi sumuran, diamati diameter zona hambat yang terbentuk setelah masa inkubasi berakhir kemudian diameter zona hambat diukur menggunakan jangka sorong. Besarnya zona hambat yang terbentuk menyatakan besarnya potensi antimikroba dari senyawa uji. Data zona hambat kemudian dianalisis statistik dengan uji normalitas Shapiro-Wilk yang dilanjutkan dengan uji Kruskal-Wallis serta uji Wilcoxon untuk mengetahui kebermaknaan dari perbedaan daya antibakteri setiap kosentrasi uji. Selanjutnya, metode dilusi padat akan didapatkan data KHM Kadar Hambat Minimum dan KBM Kadar Bunuh Minimum dari senyawa uji terhadap Porphyromonas gingivalis. Data uji antibakteri dengan dilusi padat didapat dengan melihat kekeruhan media secara visual dan dianalisis secara deskriptif. Nilai KHM dan KBM didapat dari hasil penegasan dengan metode streak plate. Identifikasi komponen minyak atsiri dilakukan menggunakan GC-MS dan dianalisis secara eksploratif-deskriptif. Komponen-komponen minyak atsiri serai wangi Jawa ditunjukkan dalam bentuk spektrum massa dan kemudian dicocokkan dengan data library yang telah ada untuk mengetahui senyawa tersebut dengan melihat tingkat kemiripan yang paling tinggi. 34

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Karakterisasi Minyak Atsiri Serai Wangi Jawa Citronella Java Oil

Tujuan dilakukannya karakterisasi yaitu untuk mengetahui sifat fisik dari minyak atsiri serai wangi Jawa secara kualitatif dimana pemeriksaan yang dilakukan meliputi pemeriksaan organoleptis, pengukuran nilai bobot jenis, dan pengukuran nilai indeks bias.

1. Pemeriksaan organoleptis minyak atsiri serai wangi Jawa

Pemeriksaan ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui kekhasan dari minyak atsiri serai wangi Jawa berdasarkan warna dan bentuk fisik minyak atsiri. Pemeriksaan dilakukan dengan menggunakan indera penglihatan. Apabila minyak atsiri yang digunakan bukan minyak atsiri yang dimaksud, maka kandungan minyak atsirinya juga berbeda dan hasil daya antibakteri juga berbeda. Tabel I. Pemeriksaan organoleptis minyak atsiri serai wangi Jawa Pemeriksaan organoleptis Hasil pemeriksaan organoleptis Warna Kuning muda Bentuk Cair Berdasarkan Certificate of Analysis CoA dari CV. Indaroma dinyatakan bahwa warna kuning muda dan berbentuk cair, sedangkan berdasarkan Panda 2003, minyak atsiri serai wangi berwarna kuning muda dan berbentuk cair. Dari hasil pemeriksaan organoleptis yang dilakukan terhadap minyak atsiri serai wangi Tabel I, telah menunjukkan kesesuaian dengan CoA dan literatur.