33
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.7 Pembuatan Larutan Kontrol
Kontrol positif yang digunakan berupa kloramfenikol dengan konsentrasi 2000 ppm dibuat dengan cara menimbang serbuk kloramfenikol sebanyak 10 mg
yang dilarutkan dalam 5 mL DMSO 100 Valgas et al., 2007. Kontrol negatif menggunakan pelarut n-heksana, etil asetat, dan metanol.
3.4.8 Penyiapan Plat KLT
Masing-masing ekstrak n-heksan, etil asetat dan metanol konsentrasi 5 mgmL ditotolkan pada plat KLT sebanyak 10 µL menggunakan mikropipet
dengan jarak tiap totolan ±2cm Ismail et al., 2011.
3.4.9 Uji Bioautografi Nonelusi Antibakteri
Suspensi bakteri Gram positif dan Gram negatif konsentrasi 10
6
CFUmL masing-masing dituang dalam cawan petri steril. Plat KLT yang telah disiapkan,
dicelupkan selama 5 detik ke dalam suspensi bakteri 10
6
CFUmL, kemudian diletakkan dalam cawan petri steril dan terdapat kapas yang dibasahi dengan
akuades. Plat KLT diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C. plat KLT disemprot
dengan larutan p-iodonitrotetrazolium violet INT dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
C. Aktivitas antibakteri terlihat dengan terbenuknya zona bening dengan latar belakang warna ungu pada plat. Pengerjaan bioautografi dilakukan
dalam laminar air flow Valgas et al., 2007.
3.4.10 KLT Bioautografi
Larutan uji yang paling aktif menunjukkan aktivitas antibakteri, selanjutnya diuji kembali dengan cara ekstrak ditotolkan pada plat KLT sebanyak 10 µL
menggunakan mikropipet dan dielusi dengan eluen etil asetat 100, n-heksan : etil asetat 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, dan 4:6. Ekstrak yang telah dielusi
dilihat dibawah sinar UV 254 nm dan bercak yang terlihat ditandai menggunakan pensil. Plat KLT tersebut dicelupkan dalam suspensi bakteri 10
6
CFUmL selama 5 detik, selanjutnya diletakkan dalam cawan petri steril yang terdapat kapas yang
dibasahi dengan akuades steril. Plat KLT diinkubasi pada suhu 37 C selama 24
jam, setelah diinkubasi plat KLT disemprot dengan larutan p-iodonitrotetrazolium violet INT, dan diinkubasi kembali selama 4 jam pada suhu 37
C. Zona
34
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
penghambatan diamati dan ditentukan nilai Rf senyawa bioaktif Ismail et al., 2011; Valgas et al., 2007 yang telah dimodifikasi.
35 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pembuatan Simplisia
Tanaman Garcinia benthami Pierre yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari Kebun Raya Bogor dan telah dilakukan determinasi di Lembaga
Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor, Jawa barat Lampiran 1.
Daun Garcinia benthami yang diperoleh sebanyak 4 kg, disortasi basah dengan cara dipisahkan dari tangkai dan pengotor yang melekat, dicuci
menggunakan air yang mengalir hingga bersih dari pengotor yang melekat pada daun. Tahapan selanjutnya yang dilakukan adalah proses pengeringan yang
bertujuan untuk menghentikan reaksi enzimatik dan mengurangi kadar air sehingga nantinya diperoleh simplisia yang tidak mudah rusak. Pengeringan
dilakukan selama 10 hari pada suhu ruang dan terhindar dari matahari langsung hal ini dilakukan untuk menghindari terjadinya kerusakan senyawa yang
terkandung didalamnya. Daun segar Garinia benthami Pierre sebanyak 4 kg setelah dilakukan
pengeringan beratnya menjadi 1,552 kg daun kering yang selanjutnya dilakukan penghalusan menggunakan blender sehingga diperoleh serbuk simplisia,
kemudian ditimbang kembali sehingga menghasilkan berat sebanyak 1,188 kg.
4.2 Pembuatan Ekstrak
Proses ekstraksi dilakukan menggunakan ekstrasi cara dingin, yaitu dengan metode maserasi. Keuntungan ekstraksi dengan cara maserasi adalah
pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana. Proses maserasi menggunakan teknik maserasi bertingkat dengan pelarut yang memiliki tingkat
kepolaran yang berbeda-beda yaitu n-heksana sebagai pelarut non polar, etil asetat sebagai pelarut semi polar dan metanol sebagai pelarut polar. Dengan
menggunakan maserasi bertingkat maka senyawa akan terkestraksi berdasarkan tingkat kepolarannya sehingga proses ekstraksi akan lebih maksimal.