dimasukkan ke dalam labu takar 5 mL. Larutan tersebut diencerkan dengan etanol p.a hingga tanda dan digojog agar homogen. Seri larutan baku dibuat sebanyak
tiga replikasi.
6. Pembuatan Larutan Baku Campuran Asam Salisilat dan Eugenol
Larutan stok baku asam salisilat diambil sebanyak 204, 255 dan 306 μL dan larutan stok baku eugenol diambil sebanyak 140, 170 dan 200 μL
menggunakan mikropipet kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 5 mL. Campuran larutan lalu diencerkan dengan etanol p.a hingga tanda dan digojog
agar homogen. Pembuatan larutan campuran baku eugenol dan asam salisilat dilakukan sebanyak lima kali replikasi.
7. Penetapan Panjang Gelombang Pengamatan
Larutan baku asam salisilat kadar 816; 952 dan 1224 ppm dan larutan baku eugenol kadar 560; 640 dan 800 ppm masing-masing tiga kali replikasi
ditotolkan sebanyak 2 µL pada plat KLT dengan fase diam silika gel 60 F
254
.
Hasil penotolan dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah jenuh dengan fase
gerak, dengan jarak pengembangan 15 cm. Lempeng hasil pengembangan dikeluarkan dari bejana lalu dikeringkan. Plat hasil pengembangan discanning
pada panjang gelombang pengamatan 250-330 nm menggunakan alat TLC scanner.
8. Penetapan kurva baku asam salisilat dan eugenol dan pengamatan nilai Retardation Factor R
f
asam salisilat dan eugenol
Seri larutan baku masing-masing ditotolkan dengan volume penotolan 2 μL pada plat KLT dengan fase diam silika gel 60 F
254
yang telah diaktifkan dan setelah kering dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi
dengan fase gerak dengan jarak pengembangan 15 cm. Setelah mencapai jarak rambat 15 cm, plat dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Plat hasil
pengembangan diukur Area Under Curve AUC dan tinggi puncaknya dengan alat TLC scanner pada panjang gelombang pengamatan 288 nm. Replikasi
dilakukan sebanyak tiga kali. Selanjutnya dihitung persamaan kurva baku, nilai koefisien determinasi dan nilai koefisien korelasinya, kemudian diplotkan dalam
grafik kadar vs AUC.
9. Validasi Metode
a. Penentuan nilai selektivitas, presisi, linearitas dan rentang. Seri larutan tunggal dan campuran baku asam salisilat dan eugenol ditotolkan dengan volume
penotolan 2 µL pada plat KLT dengan fase diam silika gel 60 GF
254
dan setelah kering dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi dengan fase
gerak. Setelah mencapai jarak rambat 15 cm, plat dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Plat hasil pengembangan diukur Area Under Curve AUC dan
tinggi puncaknya dengan alat TLC scanner pada panjang gelombang pengamatan 288 nm. Replikasi dilakukan sebanyak lima kali. Kadar terukur dihitung dengan
menggunakan persamaan kurva baku yang telah didapat. b. Penentuan nilai perolehan kembali. Konsentrasi rendah, sedang dan
tinggi dari baku eugenol dan asam salisilat ditambahkan pada ± 1 gram sampel, kemudian ditambahkan 25 mL NaOH 6M. Dilakukan pemanasan dengan refluks
dengan menggunakan mantel heater dengan suhu di jaga antara 80 C-100
C selama 3 jam. Larutan yang diperoleh disaring dengan menggunakan kertas saring
dan ditambah HCL 6M hingga pH 2. Larutan diekstraksi sebanyak 4 x 10 mL kloroform. Hasil ekstraksi dikeringkan dan setelah kering dilarutkan kembali
dengan 5 mL. Hasil tersebut ditotolkan sebanyak 2 µL pada plat KLT dengan jarak rambat 15 cm, plat dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Plat hasil
pengembangan diukur Area Under Curve AUC dan tinggi puncaknya dengan alat TLC scanner pada panjang gelombang pengamatan 288 nm. Replikasi
dilakukan sebanyak dua kali pada tiap konsentrasi baku. Kadar terukur dihitung dengan menggunakan persamaan kurva baku yang telah didapat.
10. Preparasi Sampel
