D. Alat Penelitian
a. Alat pembuatan serbuk kering P.americana
Alat – alat yang digunakan antara lain oven Memmert, mesin penyerbuk Retsch , timbangan elektrik dan ayakan nomor 40.
b. Alat pembuatan ekstrak metanol biji P.americana
Seperangkat alat gelas berupa Bekker glass, erlenmeyer, gelas ukur, labu ukur, cawan porselen, corong Buchner, pipet tetes, batang
pengaduk Pyrex Iwaki Glass®. Mesin penyerbuk Retsch®, ayakan nomor 40, Electric Sieve Shaker Indotest Multi Lab®, timbangan
analitik Mettler Toledo®, moisture balance, orbital shaker Optima®, rotary vacuum evaporator IKAVAC®, oven Memmert®.
c. Alat uji hepatoprotektif
Seperangkat alat gelas berupa Bekker glass, gelas ukur, tabung reaksi, labu ukur, pipet tetes, batang pengaduk Pyrex Iwaki Glass®,
timbangan analitik Mettler Toledo®, sentrifuge Centurion Scientific®, vortex Genie Wilten®, spuit injeksi per oral dan syringe 3 cc Terumo®,
spuit ip. dan syringe 1 cc Terumo®, pipa kapiler, tabung Eppendorf, Microlab 200 Merck®, stopwatch.
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi serbuk biji P. americana
Determinasi dilakukan dengan mencocokkan serbuk biji P. americana yang diperoleh dari Padang, Sumatera Barat dengan serbuk biji P. americana
yang dilakukan secara makroskopis dan mikroskopis. Determinasi dilakukan oleh Yohanes Dwiatamaka, M.Si yang merupakan dosen Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 2.
Pengumpulan bahan uji Bahan uji yang digunakan adalah biji P. americana Mill. yang masih
segar dan tidak busuk, diperoleh dari Sumatera Barat pada bulan Januari 2013.
3. Pembuatan serbuk biji P. americana
Biji P. americana dicuci bersih dan dipisahkan dari kulitnya. Setelah itu biji dirajang tipis lalu diangin-anginkan kemudian dikeringkan dalam oven
pada suhu 50ºC selama 24 jam untuk mengoptimalkan proses pengeringan. Setelah biji benar-benar kering, biji dihaluskan dan diayak dengan ayakan
nomor 40. Pengayakan dilakukan agar kandungan fitokimia yang terkandung dalam biji Persea americana Mill. lebih mudah tersekstrak karena luas
permukaan spesifik yang kontak dengan pelarut semakin besar. 4.
Penetapan kadar air pada serbuk kering biji P. americana Serbuk kering biji P. americana yang sudah diayak, dimasukkan
sebanyak ± 5 gram ke dalam alat moisture balance kemudian diratakan. Bobot serbuk kering biji tersebut ditetapkan sebagai bobot sebelum
pemanasan bobot A, setelah itu dipanaskan pada suhu 110 C. Serbuk kering
biji P.americana yang sudah dipanaskan ditimbang kembali dan dihitung sebagai bobot setelah pemanasan bobot B. Kemudian dilakukan perhitungan
terhadap selisih bobot A terhadap bobot B yang merupakan kadar air serbuk biji P. americana.
5. Pembuatan ekstrak metanol-air biji P.americana
Ekstrak metanol-air biji P.americana adalah ekstrak kental yang diperoleh dengan mengekstraksi serbuk kering biji P.americana seberat 10,0
g yang dilarutkan dalam 100 ml pelarut metanol 70 secara maserasi selama 120 jam 5 hari dengan sesekali diaduk, kemudian diremaserasi selama 48
jam 2 hari. Maserasi dilakukan dalam erlenmeyer bersumbar kaca dan dilakukan pada suhu kamar. Perbandingan jumlah serbuk dan pelarut adalah 1
: 10. Selama proses maserasi, campuran serbuk dan pelarut digojog selama 1 menit setiap harinya dan didiamkan dalam ruangan gelap dan ditutup. Setelah
dilakukan perendaman, hasil maserasi kemudian disaring menggunakan corong Buchner yang dilapisi kertas saring sehingga diperoleh filtrat dengan
bantuan pompa vakum. Filtrat hasil saringan dipindahkan dalam labu alas bulat untuk dievaporasi dengan mengunakan vacuum rotary evaporator pada
suhu 70 – 90 C untuk menguapkan cairan penyari pada proses maserasi. Hasil
evaporasi dituangkan dalam cawan porselen yang telah ditimbang sebelumnya agar mempermudah perhitungan rendemen ekstrak yang akan
diperoleh kemudian dipekatkan dengan menggunakan penangas air pada suhu 70 – 80
C. Penimbangan terhadap ekstrak dilakukan setiap harinya hingga diperoleh bobot ekstrak tetap. Ekstrak kental disimpan di dalam desikator
hingga saat akan digunakan.
Rendemen ekstrak = berat cawan ekstrak kental – berat cawan kosong
Rata-rata rendemen = Konsentrasi ekstrak didapat dari hasil rata-rata bobot ekstrak.
Konsentrasi yang digunakan adalah konsentrasi pekat yang dapat dibuat. Pada konsentrasi yang digunakan tersebut ekstrak dapat dimasukkan dan
dikeluarkan dari spuit oral. Cara pembuatannya adalah dengan melarutkan ekstrak setiap cawan dalam labu ukur 5 ml dengan pelarut yang sesuai CMC
Na 1. Sehingga konsentrasi ekstrak dapat ditetapkan 6.
Pembuatan larutan Natrium-Carboxy Methyl Cellulosa CMC-Na 1 Larutan CMC-Na 1 dibuat dengan cara menimbang 5 gram CMC-Na
serbuk yang telah digerus dalam mortar dan stamper terlebih dahulu. Serbuk kemudian ditaburkan secara merata di permukaan 200 mL aquadest di dalam
gelas kimia dan ditunggu hingga semua serbuk terbasahi, tanpa pengadukan. Setelah semua serbuk CMC-Na terbasahi maka dilakukan pengadukan hingga
seluruh CMC-Na larut. Larutan CMC-Na kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 500 ml dan ditambahkan aquadest hingga batas tanda.
7. Pembuatan suspensi ekstrak metanol-air biji P.americana dalam CMC-Na
1 Suspensi ekstrak metanol-air biji P. americana dibuat dengan
konsentrasi 7. Sebanyak 3,5 g ekstrak metanol-air biji P. americana ditimbang secara seksama. Kemudian dilarutkan dengan menggunakan
larutan CMC-Na 1 hingga terlarut keseluruhan dan dimasukkan ke dalam
labu takar 50 mL dan ditambah dengan larutan CMC-Na 1 hingga batas tanda, selanjutnya digojog hingga homogen.
8. Pembuatan larutan karbon tetraklorida CCl
4
konsentrasi 50 Larutan CCl
4
dalam olive oil dibuat dengan cara melarutkan 25 ml CCl
4
dalam labu takar 50 ml kemudian ditambahkan dengan olive oil hingga tanda, lalu digojog hingga homogen. Pengambilan CCl
4
dilakukan dengan menggunakan pipet gondok 25 ml.
9. Uji pendahuluan
a. Penetapan dosis hepatotoksin karbon tetraklorida
Pemilihan dosis CCl
4
dilakukan untuk mengetahui dosis CCl
4
yang mampu menyebabkan kerusakan pada hati tikus yang ditandai dengan peningkatan aktivitas ALT dan AST serum. Dosis hepatotoksin
yang digunakan dalam penelitian ini didasarkan pada hasil orientasi yang telah dilakukan. Dosis hepatotoksin yang digunakan memberikan
peningkatan aktivitas ALT dan AST serum paling tinggi pada hasil orientasi.
Menurut Janakat dan Al-Merie 2002 dosis karbon tetraklorida sebesar 2 mlkg BB menginduksi kerusakan hati pada tikus jantan galur
Wistar. Dosis tersebut mampu merusak sel-sel hati pada tikus jantan yang ditunjukkan melalui peningkatan aktivitas ALT dan AST tetapi
tidak menimbulkan kematian pada hewan uji.
b. Penetapan waktu pencuplikan darah
Penetapan waktu pencuplikan darah ditentukan melalui orientasi pada tiga kelompok perlakuan waktu, yaitu pada jam ke-0 sebelum
pemejanan karbon tetraklorida, jam ke-24 dan 48 setelah pemejanan karbon tetraklorida. Setiap kelompok perlakuan terdiri dari 5 hewan uji
yang pengambilan darahnya dilakukan melalui pembuluh sinus orbitalis mata.
Pada tikus yang terinduksi karbon tetraklorida yang dilarutkan dalam olive oil dengan perbandingan 1 : 1 pada dosis 2 mlkgBB
mencapai aktivitas ALT serum maksimal pada jam ke-24 setelah pemberian dan mulai menurun pada jam ke-48 Janakat dan Al-Merie,
2002. 10.
Pengelompokkan dan perlakuan hewan uji Hewan uji tikus jantan galur Wistar sejumlah 30 ekor
dibagi secara acak dalam 6 kelompok sama banyak. Kelompok I kelompok kontrol negatif
diberi olive oil dosis 2mlkgBB secara intraperitoneal, Kelompok II kontrol perlakuan diberikan ekstrak metanol-air biji P.americana dosis 350
mgkgBB secara peroral kemudian diambil darahnya pada jam ke-6 setelah pemberian ekstrak. Kelompok III kontrol hepatotosin diberi karbon
tertraklorida yang dilarutkan dalam olive oil 1:1 dengan dosis 2 mlkgBB secara intraperitoneal. Kelompok IV, V dan VI kelompok perlakuan diberi
ekstrak metanol-air biji P. americana dosis 350 mgkgBB, kemudian secara berturut-turut pada jam ke-1, 4 dan 6 setelah pemberian ekstrak metanol-air
dilakukan pemberian hepatotoksin karbon tetraklorida dosis 2 mlkgBB. Pada jam ke-24 setelah pemberian karbon tetraklorida, semua kelompok diambil
darahnya pada daerah sinus orbitalis mata untuk penetapan aktivitas ALT dan AST serum.
11. Pembuatan serum
Darah diambil melalui sinus orbitalis mata hewan uji dan ditampung dalam tabung eppendrof dan didiamkan selama 15 menit, lalu disentrifugasi
dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit, lalu dipisahkan dari bagian supernatannya.
12. Pengukuran aktivitas ALT dan AST serum
Micro vitalab 200 adalah alat yang digunakan untuk mengukur aktivitas ALT dan AST serum pada serum hewan uji. Sebelum melakukan pengukuran
sampel, alat divalidasi dengan menggunakan serum kontrol kontrol RocheHitachi Cobas C series. Kisaran nilai ALT serum kontrol
RocheHitachi Cobas C series adalah 26,2-41,8 UL dan AST 35,4-56,6 UL. Aktivitas enzim diukur pada panjang gelombang 340 nm, suhu 37
C. Aktivitas serum ALT dinyatakan dalam UL. Pengukuran aktivitas serum ALT
dilakukan di laboratorium Biokimia ,
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Pengukuran aktivitas ALT dan AST serum dilakukan dengan
mencampur 100 l serum dengan 1000 l reagen I, kemudian divortex selama 5 detik, didiamkan selama 2 menit, setelah itu dicampur dengan 250 l reagen
II, kemudian divortex selama 5 detik dan dibaca serapan setelah 1 menit.
F. Tata Cara Analisis Hasil
Kategori