Efek hepatoprotektif jangka panjang ekstrak metanol-air biji persea americana mill. terhadap aktivitas alt-ast serum pada tikus jantan wistar terinduksi karbon tetraklorida.

INTISARI

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek hepatoprotektif ekstrak metanol biji alpukat (Persea americana Mill.) pada tikus jantan terinduksi CCl4

dengan cara menurunkan aktivitas serum Alanine Aminotransferase (ALT) dan Aspartate Aminotransferase (AST) dan untuk mengetahui berapa dosis optimum ekstrak metanol biji alpukat untuk menimbulkan efek hepatoprotektif pada tikus jantan terinduksi CCl4.

Penelitian ini bersifat eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah. Penelitian ini menggunakan tikus jantan galur Wistar, umur 2-3 bulan dan berat ± 150-250 gram dibagi secara acak ke dalam tujuh kelompok perlakuan. Kelompok 1 (kontrol hepatotoksin) diberi CCl4 2 ml/kgBB. Kelompok II (kontrol

negatif) diberi Olive Oil. Kelompok III (kontrol ekstrak) diberi esktrak metanol biji alpukat dosis 1.400 mg/kgBB, Kelompok IV (kontrol positif) diberi Curliv®

4,05 ml/kgBB, Kelompok V-VII (perlakuan) ekstrak metanol biji alpukat dosis 1400; 700; dan 350 mg/kgBB sekali sehari selama 6 hari berturut-turut kemudian pada hari ke tujuh semua kelompok perlakuan diberi larutan CCl4 dosis 2

ml/kgBB. Pada jam ke 24 sesudahnya darah diambil dari sinus orbitalis mata untuk ditetapkan aktivitas ALT-AST serum. Data ALT-AST serum yang didapat dianalisis untuk mengetahui perbedaan aktivitas ALT-AST serum antar kelompok.

Hasil penelitian menunjukkan ekstrak metanol-air biji Persea americana

Mill. memberikan efek hepatoprotektif dengan menurunkan aktivitas serum ALT dan AST pada tikus yang terinduksi karbon tetraklorida. Ada kekerabatan dosis dengan respon yang muncul terlihat dari semakin besar dosis praperlakuan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. yang diberikan, maka semakin besar efek hepatoprotektif. Jadi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dosis 1400; 700; dan 350 mg/kgBB memiliki efek hepatoprotektif berturut-turut 96,6; 87,2; dan 78,6%. Nilai dosis optimum hepatoprotektif ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill.sebesar 1400 mg/kgBB.

Kata kunci : hepatoprotektif, ekstrak metanol biji buah alpukat (Persea americana Mill.), CCl4

ABSTRACT

This study aims to determine the hepatoprotective effect of methanol extract of avocado’s seed ( Persea americana Mill . ) in male rats induced CCl4

by decreasing the alanine aminotransferase (ALT ) and aspartate aminotransferase ( AST ) serum activity and to determine the optimum dose of methanol extract of avocado’s seed to give hepatoprotective effects in male rats induced CCl4.

This research was experimentally pure with direct sampling design. This research used male Wistar rats, age 2-3 months and weight ± 150-250 g. The rats were divided into seven treatment groups randomly. Group 1 (hepatotoxins control) was given CCl4 2 ml/kgBW . Group II (negative control) was given Olive Oil . Group III (extracts control) was given methanol extract of avocado’s seed at dose 1400 mg/kgBW, Group IV (positive control) was given Curliv ® at dose 4.05 ml/kgBW , group V - VII ( treatment ) were given methanol extract of avocado’s seed at dose 1400 ; 700 , and 350 mg/kgBW. The extract was given once daily for 6 days and then on the seventh day, all treatment groups were given CCl4 at dose of 2 ml/kgBW. Twenty-four hours later, the blood was collected

from the orbital sinus eye to be measured AST and ALT serum activity. ALT - AST data were analyzed statistically.

Based of the results of the measurement, methanol - water extract of the seeds of Persea americana Mill. has hepatoprotective effect by decreasing the activity of ALT and AST serum in rats induced carbon tetrachloride . There was a relation between dose and response which was seen from higher dose of methanol – water extract of the seeds of Persea americana Mill. given in pretreatment, will give higher hepatoprotective effect. Thus the methanol - water extract of seeds of

Persea americana Mill. at dose 1400 ; 700 ; and 350 mg/kgBW have hepatoprotective effects respectively 96.6 ; 87.2 , and 78.6 % and the optimum dose of methanol - water extract as hepatoprotector was 1400 mg/kgBW.

Keyword : hepatoprotective, methanol-water extract of avocado’s seeds (Persea americana Mill.), CCl4

i

EFEKHEPATOPROTEKTIFJANGKAPANJANGEKSTRAK

METANOL-AIRBIJI Persea americana Mill. TERHADAP AKTIVITAS ALT-AST SERUM PADA TIKUS JANTAN WISTAR TERINDUKSI

KARBON TETRAKLORIDA

Skripsi

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Farmasi

Diajukan Oleh: Robert Dwijantara Putra

NIM : 108114069

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Cukuplah kasih karunia-Ku bagimu, sebab justru dalam kelemahanlah kuasa-Ku menjadi sempurna (2 Korintus 12:9 ).

BERKAT...tidak selalu berupa emas, intan permata atau uang yang banyak, bukan pula saat kita tinggal di rumah mewah dan pergi bermobil..

Namun BERKAT adalah saat kita kuat dalam keadaan putus asa dan tetap BERSYUKUR saat tak punya apa-apa...

KEBAIKAN yg kita lakukan mungkin saja sudah DILUPAKAN orang,tapi bagaimanapun BERBUAT BAIKlah,bagaimanapun BERIKAN yg TERBAIK dr diri kita.

Pada akhirnya kita tahu bahwa ini adalah urusan antara kita dengan TUHAN kita dan ini bukan urusan antara kita dan mereka (MOTHER THERESA)

Kupersembahkan karyaku ini untuk : Tuhan Yesusku, Bapa yang selalu menopangku saat ku tak mampu dan mengangkatku saat kuterjatuh yang senantiasa memberiku kekuatan. Papa, mama, kakak dan adik-adikku untuk doa dan perhatiannya. Teman-teman yang telah hadir dan memberi semangat. Serta almamaterku tercinta.

vii PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala berkat kasih karunia dan atas segala perlindungan yang telah diberikan sehingga skripsi berjudul “EFEK HEPATOPROTEKTIF JANGKA PANJANG EKSTRAK METANOL-AIR BIJI Persea Americana MILL. TERHADAP AKTIVITAS ALT-AST SERUM PADA TIKUS JANTAN WISTAR TERINDUKSI KARBON TETRAKLORIDA” yang disusun untuk memenuhi persyaratan memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Program Studi Farmasi (S. Farm) dapat dikerjakan dengan baik dan lancar.

Penulis menyadari bahwa dalam pelaksanaan dan penyusunan skripsi ini tidak terlepas dari bantuan dan campur tangan berbagai pihak. Oleh karena itu pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada :

1. Ibu Phebe Hendra, M.Si., Ph. D., Apt. Selaku Dosen Pembimbing skripsi atas segala kesabaran dalam membimbing, memberikan masukan dan motivasi kepada penulis selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.

2. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dosen Penguji skripsi atas bantuan dan masukkan selama penyusunan skripsi.

3. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Penguji skripsi atas bantuan dan masukkan selama penyusunan skripsi dan yang telah memberikan bantuan dalam determinasi serbuk tanaman biji Persea americana Mill.

viii

4. Ibu Rini Dwiastuti, M.Si., Apt. selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah memberikan ijin dalam penggunaan semua fasilitas laboratorium untuk kepentingan penelitian ini.

5. Pak Heru, Pak Suparjiman, Pak Kayatno, Dokter Ari, Pak Ratijo, dan Pak Wagiran selaku Staff Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah membantu penulis dalam pengerjaan penelitian di laboratorium.

6. Segenap dosen dan karyawan atas ilmu yang diberikan.

7. Keluargaku terkasih, Bapak Budi Kasno, Mama Nastiti Handayani, Henry Budi Saputra, Rio Bryantara Putra dan Nina Fiona Putri yang memberikan doa, kasih sayang dan semangat kepada penulis.

8. Teman-teman “tim Persea americana Mill.”, Cilla, Dian, Lidya, Ike Kum,

Ike Kiting, Dion, Yudhita, Iren, Angel, Dara, Ita, Ote, dan Ayu atas kerja sama, bantuan, suka duka, semangat, dan perjuangan dalam menyelesaikan skripsi sampai akhir.

9. Liana Risha Gunawan yang selalu mendukung penulis dalam suka dan duka dalam pembuatan skripsi ini.

10. Teman-teman FST dan FKK 2010 yang selalu mengisi hari-hari dan memberikan semangat kepada penulis dalam pembuatan skripsi ini.

11. Seluruh teman, baik di Fakultas Farmasi maupun teman-teman lain atas dukungannya dan semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas akhir ini dengan baik.

ix

Penulis menyadari bahwa tugas akhir ini belum sempurna dan masih banyak kekurangan sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari semua pihak demi kemajuan di masa yang akan datang.

Akhir kata, penulis berharap semoga tugas akhir ini dapat bermanfaat bagi semua pihak serta memberikan sumbangan kecil bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang ilmu kefarmasian.

Yogyakarta, November 2013

x DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ii

HALAMAN PENGESAHAN ... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ... vi

PRAKATA ... vii

DAFTAR ISI ... x

DAFTAR TABEL ... xv

DAFTAR GAMBAR ... xvii

DAFTAR LAMPIRAN ... xviii

INTISARI ... xx

ABSTRACT ... xxi

BAB I. PENGANTAR ... 1

A. Latar Belakang ... 1

xi

2. Keaslian penelitian ... 4

3. Manfaat penelitian ... 5

2. Tujuan khusus ... 6

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ... 7

A. Anatomi Dan Fisiologi Hati... 7

B. Kerusakan Pada Hati... 9

1. Perlemakan hati ... 9

2. Nekrosis hati... 10

3. Kolestasis... 10

4. Sirosis hati... 11

C. Hepatotoksin ... 11

1. Hepatotoksin teramalkan ... 11

2. Hepatotoksin tak teramalkan ... 12

D. Karbon Tetraklorida ... 13

E. Pemeriksaan Biokimiawi Hati ... 17

F. Kandungan Fitokimia Biji Persea americana Mill.... 18

G. Sirup Curliv®Plus ... 20

H. Ekstrak ... 22

I. Landasan Teori ... 24

J. Hipotesis ... 26 B. Tujuan Penelitian ...

xii

BAB III. METODE PENELITIAN ... 27

A. Jenis Dan Rancangan Penelitian ... 27

B. Variabel Dan Definisi Operasional ... 27

1. Variabel utama ... 27

2. Variabel pengacau terkendali ... 27

3. Variabel pengacau tak terkendali ... 28

4. Definisi operasional ... 28

C. Subyek Dan Bahan Penelitian ... 29

1. Subyek penelitian ... 29

2. Bahan penelitian ... 29

D. Alat Dan Instrumen Penelitian ... 30

E. Tata Cara Penelitian ... 31

1. Determinasi serbuk tanaman Persea americana Mill.... 31

2. Pengumpulan bahan ... 31

3. Pembuatan serbuk ... 31

4. Pembuatan ekstrak metanol biji Persea americana Mill..... 32

5. Pembuatan larutan Natrium - Carboxy Methyl Cellulos a (CMC-Na) 1% ... 32

6. Pembuatan suspensi ekstrak metanol – air Persea americana Mill. dalam CMC-Na 1 % ... 33

7. Pembuatan larutan karbon tetraklorida (CCl4) konsentrasi 50% ... 33

8. Penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill. ... 33

xiii

10. Uji pendahuluan ... 34

11. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji ... 35

12. Pembuatan serum ... 36

13. Penetapan aktivitas serum ALT dan serum AST ... 36

F. Tata Cara Analisis Hasil ... 37

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 38

A. Penyiapan Bahan ... 38

1. Determinasi serbuk ... 38

2. Penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill..... 39

3. Hasil penimbangan bobot ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill... 39

B. Uji Pendahuluan ... 40

1. Penentuan dosis hepatotoksin karbon tetraklorida ... 40

2. Penentuan waktu pencuplikan darah hewan uji ... 41

3. Penetapan lama pemejanan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. ... 44

4. Penetapan dosis ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill.... 45

C. Hasil Uji Efek Hepatoprotektif Pemberian Ekstrak Metanol-Air Biji Persea americana Mill. ... 45

1. Kontrol negatif olive oil dosis 2 ml/kgBB ... 50

2. Kontrol hepatotoksin karbon tetraklorida dosis 2 ml/kgBB ... 53

3. Kontrol ekstrak metanol - air biji Persea americana Mill. dosis 1400 mg/kgBB ... 54

xiv

4. Kontrol positif curliv® dosis 4,05 ml/kgBB ... 55

5. Kelompok perlakuan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dosis 350; 700 dan 1400 mg/kgBB pada tikus jantan galur wistar terinduksi karbon tetraklorida dosis 2 ml/kgBB ... 56

D. Rangkuman Pembahasan ... 61

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 64

A. Kesimpulan ... 64

B. Saran ... 64

DAFTAR PUSTAKA ... 65

LAMPIRAN ... 69

xv

DAFTAR TABEL

Tabel I. Peningkatan aktivitas enzim serum akibat induksi senyawa

toksik ... 17

Tabel II. Kandungan fitokimia dari Persea americana pada daun, buah

dan biji ... ... 19

Tabel III. Rata-rata aktivitas serum ALT tikus setelah induksi karbon tetraklorida dosis 2 ml/kgBB pada selang waktu pencuplikan darah jam ke-0, jam ke-24, dan jam ke-48 ... 41 Tabel IV. Hasil uji Scheffe aktivitas serum ALT tikus setelah induksi

karbon tetraklorida dosis 2 ml/kg BB pada pencuplikan darah jam ke-0, jam ke-24, dan jam ke-48 ... 42 Tabel V. Rata-rata aktivitas serum AST tikus setelah induksi karbon

tetraklorida dosis 2 ml/kgBB pada selang waktu pencuplikan

darah jam ke-0, jam ke-24, dan jam ke-48 ... 43

Tabel VI. Hasil uji Scheffe aktivitas serum AST tikus setelah induksi karbon tetraklorida dosis 2 ml/kg BB pada pencuplikan darah jam ke-0, jam ke-24, dan jam ke-48 ... 44 Tabel VII. Purata ± SE aktivitas ALT dan AST tikus praperlakuan

xvi

karbon tetraklorida dosis 2 ml/kgBB ... 46 Tabel VIII. Hasil uji statistik uji Man Whitney aktivitas ALT tikus

setelah pemberian karbon tetraklorida dosis 2 ml/kgBB

pada kelompok perlakuan ... 47 Tabel IX. Hasil uji statistik uji Scheffe aktivitas AST tikus setelah

pemberian karbon tetraklorida dosis 2 ml/kgBB pada

kelompok perlakuan ... 49 Tabel X. Perbandingan kontrol olive oil jam ke-0 dan jam ke-24

pada serum ALT dan serum AST tikus ... 51 Tabel XI. Hasil penetapan kadar air serbuk biji Persea americana

Mill. ... 129 Tabel XII. Hasil rendemen ekstrak metanol-air biji Persea americana

Mill. ... 129 Tabel XIII. Bobot pengeringan ekstrak metanol - air biji Persea

americana Mill. ... 130 Tabel XIV. Hasil validitas dan reabilitas pengukuran ALT ... 130 Tabel XV. Hasil validitas dan reabilitas pengukuran AST ... 131

xvii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Mekanisme biotransformasi dan oksidasi karbon tetraklorida 15 Gambar 2. Diagram batang rata-rata aktivitas serum ALT tikus setelah

induksi karbon tetraklorida dosis 2 ml/kg BB pada

pencuplikan darah jam ke-0, jam ke-24, dan jam ke-48 ... 41 Gambar 3. Diagram batang rata-rata aktivitas serum AST tikus setelah

induksi karbon tetraklorida dosis 2 ml/kg BB pada

pencuplikan darah jam ke-0, jam ke-24, dan jam ke-48 ... 43 Gambar 4. Diagram batang rata-rata aktivitas serum ALT tikus pra-

perlakuan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill 1 x sehari selama 6 hari terinduksi karbon tetraklorida 2 ml/kgBB ... 48 Gambar 5. Diagram batang rata-rata aktivitas serum AST tikus pra-

perlakuan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill 1 x sehari selama 6 hari terinduksi karbon tetraklorida 2 ml/kgBB ... 50 Gambar 6. Diagram batang rata-rata perbandingan serum ALT kontrol

olive oil jam ke-0 dan kontrol olive oil jam ke-24 ... 51 Gambar 7. Diagram batang rata-rata perbandingan serum AST kontrol

xviii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Foto serbuk biji Persea americana Mill. ... 70

Lampiran 2. Foto ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. ... 70

Lampiran 3. Foto suspensi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dalam CMC-Na 1% ... 70 Lampiran 4. Sirup Curliv Plus® ... 71 Lampiran 5. Surat pengesahan determinasi serbuk biji Persea americana

Mill. ... 72 Lampiran 6. Surat pengesahan Medical and Health Research Ethics

Committee (MHREC) ... 73 Lampiran 7. Analisis statistik aktivitas serum ALT dan AST pada uji

pendahuluan penentuan dosis hepatotoksin karbon tetraklorida dosis 2 ml/kgBB ... 74 Lampiran 8. Analisis statistik aktivitas serum ALT perlakuan ekstrak

metanol-air biji Persea americana setelah induksi karbon tetraklorida dosis 2 ml/kgBB ... 83 Lampiran 9. Analisis statistik serum AST perlakuan ekstrak metanol-air

biji Persea americana Mill setelah induksi karbon tetraklorida dosis 2 ml/kgBB ... 102 Lampiran 10. Analisis statistik aktivitas serum ALT dan serum AST

xix

Lampiran 11. Perhitungan efek hepatoprotektif ... 126

Lampiran 12. Perhitungan daya hepatoprotektif ekstrak metanol biji Persea americana Mill. dibandingkan dengan kontrol positif Curliv® ... 126

Lampiran 13. Perhitungan penetapan peringkat dosis ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. kelompok perlakuan ... 127

Lampiran 14. Perhitungan konversi dosis untuk manusia ... 128

Lampiran 15. Perhitungan konversi hari untuk manusia ... 128

Lampiran 16. Penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill. ... 129

Lampiran 17. Hasil rendemen ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. ... 129

Lampiran 18. Bobot pengeringan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. ... 130

xx INTISARI

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek hepatoprotektif ekstrak metanol biji alpukat (Persea americana Mill.) pada tikus jantan terinduksi CCl4 dengan cara menurunkan aktivitas serum Alanine Aminotransferase (ALT) dan Aspartate Aminotransferase (AST) dan untuk mengetahui berapa dosis optimum ekstrak metanol biji alpukat untuk menimbulkan efek hepatoprotektif pada tikus jantan terinduksi CCl4.

Penelitian ini bersifat eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah. Penelitian ini menggunakan tikus jantan galur Wistar, umur 2-3 bulan dan berat ± 150-250 gram dibagi secara acak ke dalam tujuh kelompok perlakuan. Kelompok 1 (kontrol hepatotoksin) diberi CCl4 2 ml/kgBB. Kelompok II (kontrol negatif) diberi Olive Oil. Kelompok III (kontrol ekstrak) diberi esktrak metanol biji alpukat dosis 1.400 mg/kgBB, Kelompok IV (kontrol positif) diberi Curliv®

4,05 ml/kgBB, Kelompok V-VII (perlakuan) ekstrak metanol biji alpukat dosis 1400; 700; dan 350 mg/kgBB sekali sehari selama 6 hari berturut-turut kemudian pada hari ke tujuh semua kelompok perlakuan diberi larutan CCl4 dosis 2 ml/kgBB. Pada jam ke 24 sesudahnya darah diambil dari sinus orbitalis mata untuk ditetapkan aktivitas ALT-AST serum. Data ALT-AST serum yang didapat dianalisis untuk mengetahui perbedaan aktivitas ALT-AST serum antar kelompok.

Hasil penelitian menunjukkan ekstrak metanol-air biji Persea americana

Mill. memberikan efek hepatoprotektif dengan menurunkan aktivitas serum ALT dan AST pada tikus yang terinduksi karbon tetraklorida. Ada kekerabatan dosis dengan respon yang muncul terlihat dari semakin besar dosis praperlakuan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. yang diberikan, maka semakin besar efek hepatoprotektif. Jadi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dosis 1400; 700; dan 350 mg/kgBB memiliki efek hepatoprotektif berturut-turut 96,6; 87,2; dan 78,6%. Nilai dosis optimum hepatoprotektif ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill.sebesar 1400 mg/kgBB.

Kata kunci : hepatoprotektif, ekstrak metanol biji buah alpukat (Persea americana Mill.), CCl4

xxi ABSTRACT

This study aims to determine the hepatoprotective effect of methanol extract of avocado’s seed ( Persea americana Mill . ) in male rats induced CCl4 by decreasing the alanine aminotransferase (ALT ) and aspartate aminotransferase ( AST ) serum activity and to determine the optimum dose of methanol extract of avocado’s seed to give hepatoprotective effects in male rats induced CCl4.

This research was experimentally pure with direct sampling design. This research used male Wistar rats, age 2-3 months and weight ± 150-250 g. The rats were divided into seven treatment groups randomly. Group 1 (hepatotoxins control) was given CCl4 2 ml/kgBW . Group II (negative control) was given Olive

Oil . Group III (extracts control) was given methanol extract of avocado’s seed at dose 1400 mg/kgBW, Group IV (positive control) was given Curliv ® at dose 4.05 ml/kgBW , group V - VII ( treatment ) were given methanol extract of avocado’s seed at dose 1400 ; 700 , and 350 mg/kgBW. The extract was given once daily for 6 days and then on the seventh day, all treatment groups were given CCl4 at dose of 2 ml/kgBW. Twenty-four hours later, the blood was collected from the orbital sinus eye to be measured AST and ALT serum activity. ALT - AST data were analyzed statistically.

Based of the results of the measurement, methanol - water extract of the seeds of Persea americana Mill. has hepatoprotective effect by decreasing the activity of ALT and AST serum in rats induced carbon tetrachloride . There was a relation between dose and response which was seen from higher dose of methanol – water extract of the seeds of Persea americana Mill. given in pretreatment, will give higher hepatoprotective effect. Thus the methanol - water extract of seeds of

Persea americana Mill. at dose 1400 ; 700 ; and 350 mg/kgBW have hepatoprotective effects respectively 96.6 ; 87.2 , and 78.6 % and the optimum dose of methanol - water extract as hepatoprotector was 1400 mg/kgBW.

Keyword : hepatoprotective, methanol-water extract of avocado’s seeds (Persea americana Mill.), CCl4

1 BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang

Hati merupakan organ yang berperan penting dalam banyak proses metabolisme. Darah yang mengandung nutrisi dari saluran gastrointestinal terlebih dahulu melewati vena portal di hati, dimana nutrisi seperti karbohidrat, lemak dan vitamin dapat dipindahkan dan disimpan dalam jangka waktu tertentu hingga nutrisi tersebut dibutuhkan. Sel-sel hati mampu memetabolisme karbohidrat, lemak, dan protein. Hati mampu mensintesis dan mensekresi empedu, yang mengandung air, ion-ion, lemak-lemak (turunan kolesterol yang dikenal sebagai garam empedu) dan pigmen empedu seperti bilirubin (Stine dan Brown, 1996).

Aneka penyakit pada hati termasuk penyakit yang paling serius yang dapat dikelompokkan menjadi hepatitis (penyakit radang pada hati) akut dan kronis, hepatosis (penyakit hati tanpa peradangan) dan sirosis (penyakit degeneratif menyebabkan fibrosa pada hati). Faktor-faktor penyebab kerusakan pada hati karena induksi oleh obat atau racun seperti konsumsi alkohol yang berlebihan, antibiotik tertentu, kemoterapi, minyak terperoksidasi, aflatoksin, karbontetraklorida, hidrokarbon terklorinasi dan zat-zat toksik lainnya dan reaksi imunologi (Williamson, David, dan Fred, 1996). Keracunan hati pada pasien yang menderita penyakit kuning diperkirakan 2% disebabkan oleh induksi obat dan 3-10% diantaranya mempengaruhi hati. Penelitian yang dilakukan pada tahun

1960-1970 memberikan gambaran bahwa obat atau toksikan menyebabkan kira-kira 10% dari seluruh kasus hepatitis atau kira-kira 20-30% dari kasus penyakit hati akut. Beberapa penelitian terbaru melaporkan bahwa 15-40% kasus penyakit hati akut diperantarai oleh obat-obatan (Cadman, 2000).

Salah satu senyawa yang dapat digunakan sebagai senyawa model yang dapat menimbulkan kerusakan pada hati adalah karbon tetraklorida (CCl4). CCl4 merupakan xenobiotik yang lazim digunakan untuk menginduksi peroksidasi lipid dan keracunan. Dalam endoplasmik retikulum hati CCl4 dimetabolisme oleh sitokrom P450 2E1 (CYP2E1) menjadi radikal triklorometil (CCl3*). Triklorometil dengan oksigen membentuk radikal triklorometilperoxi yang menyerang lipid membran endoplasmik retikulum dan akhirnya menyebabkan kematian sel (Panjaitan, Handharyani, Chairul, Masriani, Zakiah dan Manalu, 2007).

Obat-obatan untuk mengatasi kerusakan hati masih jarang ditemukan di Indonesia. Maka dari itu dalam penelitian ini akan dicari alternatif terapi pengobatan dari sumber daya alam. Salah satu tanaman yang dapat digunakan sebagai obat tradisional adalah alpukat. Alpukat merupakan tanaman yang dapat tumbuh subur di Indonesia dan merupakan salah satu jenis buah yang digemari banyak orang karena selain rasanya enak, buah alpukat juga kaya antioksidan dan zat gizi seperti lemak yaitu 9,8 g/100g daging buah (Afrianti, 2010). Sebagian besar masyarakat memanfaatkan alpukat pada buahnya saja sedangkan bagian lain seperti biji kurang dimanfaatkan. Biji alpukat dipercaya dapat mengobati sakit gigi, maag kronis, hipertensi dan diabetes militus melalui kemampuannya

menurunkan kadar glukosa darah (Zuhrotun, 2007). Hasil skrining fitokimia yang dilakukan oleh Zuhrotun (2007) terhadap simplisia dan ekstrak etanol biji alpukat menunjukkan bahwa biji alpukat mengandung polifenol, flavonoid, triterpenoid, kuinon, saponin, tanin, monoterpenoid dan seskuiterpenoid.

Biji alpukat (Persea americana Mill.) mengandung berbagai macam senyawa metabolit sekunder. Salah satunya adalah senyawa golongan fenolik. Senyawa fenolik dapat berfungsi sebagai antioksidan karena dapat mengalami reaksi redoks, yang menyebabkan senyawa tersebut dapat berfungsi sebagai agen pereduksi, donor hidrogen, penetral radikal bebas dan pengkhelat logam. Antioksidan dalam pengertian kimia merupakan senyawa pemberi elektron. Antioksidan bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa yang bersifat oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut bisa terhambat. Antioksidan menstabilkan radikal bebas dengan melengkapi kekurangan elektron yang dimiliki radikal bebas dan menghambat terjadinya reaksi berantai dari pemberian radikal bebas (Winarsi, 2007). Berdasarkan kemampuannya sebagai antioksidan dimungkinkan biji alpukat juga memiliki khasiat sebagai hepatoprotektor. Senyawa hepatoprotektor merupakan senyawa yang dapat melindungi sel-sel hati dari kerusakan. Sepanjang pengetahuan peneliti, penelitian mengenai aktivitas hepatoprotektif biji alpukat belum pernah dilakukan.

Pada penelitian ini digunakan ekstrak metanol biji alpukat. Pemilihan ekstrak metanol berdasarkan penelitian sebelumnya. Pada penelitian efek antioksidan biji alpukat (Persea americana Mill.) telah diketahui bahwa senyawa fenolik yang berkhasiat sebagai antioksidan dapat terambil dengan baik dari biji

Persea americana Mill. dengan menggunakan pelarut metanol (Carpena, Morcuende, Andrade, Kylli dan Estevez, 2011). Pemberian ekstrak metanol biji alpukat secara jangka panjang pada hewan uji tikus jantan wistar yaitu selama 6 hari karena perlakuan selama 6 hari pada hewan uji tikus jika dikonversikan untuk manusia sama dengan 204 hari.

1. Perumusan masalah

a. Apakah ekstrak metanol biji alpukat mempunyai efek hepatoprotektif pada tikus jantan terinduksi karbon tetraklorida dengan cara menurunkan aktivitas Alanine Aminotransferase (ALT) serum dan Aspartate Transaminase (AST) serum ?

b. Berapa besar dosis optimum ekstrak metanol biji alpukat untuk menimbulkan efek hepatoprotektif pada tikus jantan terinduksi karbon tetraklorida ?

2. Keaslian penelitian

Penelitian yang telah dilakukan berkaitan dengan biji Persea americana

Mill. yaitu :

a. Penelitian yang dilakukan oleh Arukwe, dkk (2012). Penelitian tersebut dilakukan untuk mengetahui kandungan dari biji, daun, dan buah Persea americana. Pada penelitian tersebut, meskipun dilakukan analisis kandungan biji Persea americana namun khasiat kandungan biji Persea americana tidak diteliti.

b. Penelitian yang dilakukan oleh Carpena, dkk (2011). Penelitian ini melakukan uji secara in vitro mengenai aktivitas antioksidan dan anti

mikroba biji Persea americana Mill. Pada penelitian tersebut tidak dilakukan uji aktivitas Persea americana Mill. untuk digunakan sebagai hepatoprotektor.

c. Penelitian yang dilakukan oleh Zuhrotun (2007). Penelitian tersebut menguji aktivitas antidiabetes dari ekstrak etanol biji Persea americana

Mill. namun tidak dilakukan uji aktivitas hepatoprotektif.

Pada penelitian yang akan dilakukan bertujuan untuk menguji aktivitas ekstrak metanol biji Persea americana Mill. sebagai hepatoprotektor secara jangka panjang dan untuk mengetahui dosis efektif dari ekstrak metanol biji

Persea americana Mill. sebagai hepatoprotektor.

Penelitian tentang efek hepatoprotektif ekstrak metanol biji Persea americana Mill. pada tikus jantan wistar terinduksi karbon tetraklorida secara jangka panjang belum pernah dilakukan sebelumnya.

3. Manfaat penelitian 1. Manfaat teoritis

Hasil penelitian ini diharapkan mampu memberikan tambahan ilmu pengetahuan tentang tanaman yang memiliki khasiat hepatoprotektif. 2. Manfaat praktis

Hasil penelitian ini diharapkan dapat mengetahui dosis optimum jangka panjang penggunaan tanaman biji alpukat oleh masyarakat khususnya sebagai alternatif pengobatan bagi para penderita penyakit hati.

B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum

Penelitian dilakukan untuk mendapatkan informasi mengenai efek hepatoprotektif ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. secara jamgka panjang untuk pengembangan ilmu kefarmasian.

2. Tujuan khusus

a. Untuk mengetahui efek hepatoprotektif ekstrak metanol biji alpukat pada tikus jantan terinduksi karbon tetraklorida dengan cara menurunkan aktivitas ALT & AST serum.

b. Untuk mengetahui besar dosis optimum ekstrak metanol biji alpukat untuk menimbulkan efek hepatoprotektif pada tikus jantan terinduksi karbon tetraklorida.

7 BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Anatomi dan Fisiologi Hati

Hati merupakan organ yang berperan penting dalam banyak proses metabolisme. Darah yang mengandung nutrisi dari saluran gastrointestinal terlebih dahulu melewati vena portal di hati, di mana nutrisi seperti karbohidrat, lemak dan vitamin dapat dipindahkan dan disimpan dalam jangka waktu tertentu hingga nutrisi tersebut dibutuhkan. Sel-sel hati mampu memetabolisme karbohidrat, lemak, dan protein. Hati mampu mensintesis dan mensekresi empedu, yang mengandung air, ion-ion, lemak-lemak (turunan kolesterol yang dikenal sebagai garam empedu) dan pigmen empedu seperti bilirubin (Stine dan Brown, 1996).

Hati adalah organ yang terbesar yang terletak di sebelah kanan atas rongga perut di bawah diafragma. Beratnya 1.500 g atau 2,5 % dari berat badan orang dewasa normal. Pada kondisi hidup berwarna merah tua karena kaya akan persediaan darah. Hati terbagi menjadi lobus kiri dan lobus kanan yang dipisahkan oleh ligamentum falciforme. Hati disuplai oleh dua pembuluh darah yaitu Vena porta hepatica yang berasal dari lambung dan usus, yang kaya akan nutrien seperti asam amino, monosakarida, vitamin yang larut dalam air, dan mineral dan Arteri hepatica, cabang dari arteri kuliaka yang kaya akan oksigen. Cabang-cabang pembuluh darah vena porta hepatica dan arteri hepatica mengalirkan darahnya ke sinusoid. Hematosit menyerap nutrien, oksigen, dan zat racun dari darah sinusoid.

Di dalam hematosit zat racun akan dinetralkan sedangkan nutrien akan ditimbun atau dibentuk zat baru, dimana zat tersebut akan disekresikan ke peredaran darah tubuh (Lingappa, 1995)

Sel-sel hati tersusun dalam pola heksagonal khusus, dikenal sebagai lobulus (Stine dan Brown, 1996). Lobulus hati berbentuk silindris dengan panjang beberapa milimeter dan berdiameter 0,8 sampai 2 milimeter. Hati manusia berisi 50.000 sampai 100.000 lobulus (Guyton dan Hall, 1996). Sel-sel epitel disebut hepatosit tersusun menyebar di luar vena sentral (cabang vena hepatik). Di antara kolom-kolom hepatosit terdapat saluran yang disebut sinusoid. Pada sinusoid menempal sel-sel endotelial dengan permeabilitas tinggi. Sinusoid juga mengandung sel-sel fagosit disebut sel-sel Kupffer. Tiga pembuluh lainnya di setiap sudut luar heksagon (area portal): cabang vena portal, cabang dari arteri hepatik, dan saluran empedu. Darah mengalir ke dalam hati melalui cabang arteri hepatik dan vena portal, melalui sinusoid, dan mengalir keluar melalui vena sentral. Empedu dihasilkan di hepatosit dan mengalir keluar melalui kanalikuli empedu (terletak di antara perbatasan hepatosit) menuju saluran empedu. Lobulus-lobulus bukanlah unit fungsional yang berdiri sendiri-sendiri. Setiap pasang vena portal/ arteri hepatik mengalirkan darah tidak hanya ke satu lobulus, tetapi ke suatu area sel-sel yang meliputi 2 lobulus atau lebih. Area ini disebut asinus (Stine dan Brown, 1996).

Hati mempunyai bermacam-macam fungsi dengan 3 fungsi utama dalam tubuh yaitu untuk sintesis, ekskresi dan metabolisme (Chandrasoma dan Taylor, 1995). Fungsi utama hati adalah membentuk dan mengekskresikan empedu;

saluran empedu mengangkut empedu sedangkan kandungan empedu menyimpan dan mengeluarkan empedu ke dalam usus halus sesuai kebutuhan (Price dan Wilson, 2005).

Fungsi metabolisme hati yang lain adalah metabolisme lemak; penimbunan vitamin, besi dan tembaga; konjugasi dan ekskresi steroid adrenal dan gonad, serta detoksifikasi sejumlah zat endogen dan eksogen. Fungsi detoksifikasi sangat penting dan dilakukan oleh enzim hati melalui oksidasi, reduksi, hidrolisis, atau konjugasi zat-zat yang dapat berbahaya, dan mengubahnya menjadi zat yang secara fisiologis tidak aktif (Price dan Wilson, 2005). Untuk menjalankan fungsi tersebut, hati dilengkapi dengan sistem vaskuler hepatika (Guyton, 1983). Sistem vaskuler hepatika memungkinkan hati sebagai tempat utama metabolisme (biotransformasi) obat induk menjadi metabolitnya (Donatus, 1992).

Hati yang normal mempunyai kapasitas cadangan yang besar untuk melakukan fungsinya. Dalam keadaan normal, 80% bagian dari hati dapat dihentikan aktivitasnya tanpa harus mengurangi fungsinya (Chandrasoma dan Taylor, 1995).

B. Kerusakan Pada Hati

Kerusakan hati dapat berupa perlemakan hati, nekrosis, kolestatis dan sirosis hati (Price dan Wilson, 2005).

1. Perlemakan hati

Perlemakan hati adalah penumpukan lemak lebih dari 5% pada organ hati. Penyebab perlemakan hati terdiri dari dua faktor utama. Pertama

berhubungan dengan peningkatan kadar asam lemak bebas dalam plasma yang terjadi akibat mobilisasi lemak dari jaringan adiposa atau dari hidrolisis triasilgliserol lipoprotein oleh lipase sensitif hormone di jaringan ekstrahepatik. Pembentukan Very Low Density Lipoprotein (VLDL) tidak dapat mengimbangi meningkatnya influx dan esterifikasi asam lemak bebas sehingga terjadi penumpukan triasilgliserol yang menyebabkan perlemakan hati. Kedua, karena adanya penghambatan metabolik dalam produksi lipoprotein plasma sehingga terjadi penimbunan triasilgliserol (Muray, Daryl, dan Victor, 2009).

2. Nekrosis hati

Nekrosis merupakan kematian sel hati yang ditandai dengan rusaknya struktur lobulus hati. Manifestasi dari toksikan yang berbahaya dapat menimbulkan nekrosis. Perubahan biokimia yang terjadi bersifat kompleks dan berbagai hepatotoksikan bekerja melalui berbagai mekanisme. Mekanisme terjadinya nekrosis diantaranya hepatotoksikan secara kovalen mengikat protein dan lipid tidak jenuh dan menyebabkan peroksidasi lipid (Price dan Wilson, 2005). Nekrosis biasanya didahului oleh perubahan morfoligik sel-sel hati, seperti rusaknya inti sel, homogenisasi sitoplasma, dan pecahnya membran plasma (Lu, 1995).

3. Kolestasis

Kolestatis merupakan kerusakan hati yang bersifat akut dan disebabkan karena aktifitas ekskresi empedu pada membran kanalikuli biliaris. Penyakit kolestatis lebih jarang ditemukan dibandingkan dengan perlemakan hati dan nekrosis (Lu, 1995).

4. Sirosis hati

Sirosis yaitu suatu keadaan berupa penggantian hepatosit yang rusak secara permanen oleh jaringan ikat. Sirosis ditandai dengan adanya septa kolagen yang tersebar di sebagian besar hati. Peradangan hati yang berkepanjangan atau berulang umumnya berkaitan dengan alkoholisme kronik dapat menyebabkan sirosis. Hepatosit memiliki kemampuan untuk beregenerasi cukup cepat untuk menggantikan sel-sel yang rusak (Price dan Wilson, 2005).

Ada banyak tipe sirosis, berkaitan dengan berbagai sebab : portal, nutrisional, dan sirosis alkoholis. Kerusakan hati ini disebabkan oleh salah gizi, kesenjangan protein makanan dan peminum berat pada periode yang panjang. Gejala permulaan tidak jelas, pada penderita sirosis biasanya mempunyai gangguan lambung, kehilangan nafsu makan, gangguan pencernaan, mual, muntah, sembelit atau diare dan sakit perut berkepanjangan (Cooper, 1996).

C. Hepatotoksin

Kerusakan hati akut, subakut maupan kronis dapat ditimbulkan oleh hepatotoksin yaitu senyawa kimia yang memiliki efek toksik terhadap hati, dengan dosis berlebihan atau pemejanan dalam jangka waktu yang lama (Zimmerman, 1978).

Obat atau senyawa kimia yang dapat menyebabkan kerusakan hati dapat dibedakan menjadi dua, yaitu :

1. Hepatotoksin teramalkan (intrinsik)

Merupakan obat atau senyawa kimia yang pada dasarnya mempunyai sifat toksik terhadap sel hati. Contoh hepatotoksin teramalkan yang dapat

menimbulkan kerusakan nekrosis hepatoseluler adalah racun jamur (Amanita phalloides), aflatoksin, karbontetraklorida, kloroform, parasetamol dan lain sebagainya (Chandrasoma dan Taylor, 1995). Prosesnya dikenal sebagai toksisitas-intrinsik, dan aksinya dapat terjadi secara langsung atau tidak langsung. Secara langsung maksudnya obat induk atau metabolitnya langsung berikatan dengan komponen membran sel dan merusak sel hati beserta seluruh organelnya, seperti ditunjukkan CCl4 dan parasetamol. Secara tidak langsung maksudnya obat induk atau obat bentuk metabolitnya dalam menimbulkan luka hepatik dengan cara mengganggu jalur metabolik-khas (misalnya tetrasiklin), atau menggangu jalur ekskresi hepatik (misalnya rifampisin) (Donatus, 1992). Kerusakan yang ditimbulkan bergantung dosis dan dapat dicobakan pada hewan uji dan menyebabkab lesi yang mirip manusia (Zimmerman, 1978).

2. Hepatotoksin tak teramalkan (idiosinkratik)

Senyawa yang termasuk dalam golongan ini yaitu senyawa yang memiliki sifat tidak toksik pada hati, akan tetapi dapat menyebabkan penyakit hati pada individu yang hipersensitif terhadap senyawa tersebut yang diperantarai oleh mekanisme alergi (misalnya sulfonamid, halotan) atau karena keabnormalan metabolik menuju penumpukan metabolit toksik (misalnya iproniazid, isoniazid) (Zimmerman, 1978; Donatus, 1992). Kerusakan hati yang ditimbulkan oleh hepatotoksin golongan ini tidak dapat diperkirakan dan tidak tergantung pada dosis (Donatus, 1992).

D. Karbon tetraklorida

Senyawa ini merupakan senyawa sintesis yang tidak terdapat dalam alam secara alami. Karbon tetraklorida berupa cairan bening, berbau manis yang dapat tercium pada jumlah rendah. Karbon tetraklorida juga disebut metanatetraklorida. Karbon tetraklorida paling sering dijumpai dalam bentuk gas tidak berwarna, tidak mudah terbakar, dan sukar larut dalam air. Karbon tetraklorida digunakan dalam produksi cairan untuk lemari es, bahan campuran propelan untuk kaleng aerosol, pestisida, cairan pembersih, minyak pelumas, bahan pemadam kebakaran, dan penghapus noda. Namun sekarang penggunaan karbon tetraklorida dilarang karena efeknya yang berbahaya. Karbon tetraklorida saat ini hanya digunakan untuk keperluan industri (Klassen, 1995).

Pemberian CCl4 secara intragastrikal, subkutan, intraperitoneal dan inhalasi dapat menunjukkan ciri kerusakan nekrosis sentrilobuler dan steatosis (Zimmerman, 1978). Karbon tetraklorida (CCl4) didistribusikan secara cepat keseluruh organ dan jaringan, dengan kadar tertinggi pada lemak jaringan, hati dan sumsum tulang (Zimmerman, 1978). Hati merupakan organ yang paling sensitif terhadap CCl4 karena fungsi metabolismenya. Ginjal juga dirusak karena fungsi ekskresinya. Pada paparan CCl4 dalam tingkat ringan dan kemudian berhenti, hati dan ginjal mampu memperbaiki sel-sel yang dirusak dan berfungsi normal kembali. Pada paparan terlalu tinggi, sistem saraf termasuk otak dipengaruhi. Penderita dapat mengalami sakit kepala, pusing, mengantuk, mual dan muntah. Efek-efek tersebut dapat mereda jika paparan dapat dihentikan. Pada

kasus keterpaparan yang parah, koma dan bahkan kematian dapat terjadi (Loomis, 1978).

Efek toksik selektif dari CCl4 pada sel hati ditandai dengan terjadinya degenerasi melemak makrovesikuler dan nekrosis sentrilobuler atau salah satu dari kedua tanda tersebut tergantung dosis CCl4 yang diberikan. Degenerasi melemak sel-sel hati hewan percobaan mulai terjadi dalam waktu 1 jam setelah pemberian CCl4 dimana pada saat itu konsentrasi CCl4 dalam hati mencapai puncak. Nekrosis hati mulai tampak dari 6 sampai 12 jam dan mencapai puncak pada 24 sampai 36 jam setelah pemejanan (Zimmerman, 1978).

Tanda-tanda awal kerusakan hepatoseluler pada hati meliputi peruraian polisom dan ribosom dari retikulum endoplasma kasar, penghambatan sintesis protein dan akumulasi trigliserida. Karbon tetraklorida yang diingesti memasuki hati, mengalami aktivasi metabolit, menghasilkan lipoperoksidasi, pengikatan secara kovalen, dan penghambatan aktivitas mikrosomal ATPase. Nekrosis sel tunggal terjadi dalam 5-6 jam sesudah ingesti, berkembang menjadi nekrosis sentrilobuler maksimum dalam 24-48 jam sesudah ingesti. Aktivitas enzim mikrosomal menurun. Berbagai enzim sitoplasmik dilepaskan hepatosit ke dalam aliran darah. Aktivitas enzim-enzim tersebut di dalam serum berhubungan dengan kehadiran nekrosis pada hati. Regenerasi seluler ditunjukkan dengan peningkatan sintesis DNA dan siklus sel, maksimal 36-48 jam sesudah ingesti. Kecepatan dan jumlah perbaikan jaringan untuk menentukan bentuk kerusakan hati (Bruckner dan Warren, 2001).

Gambar 1. Mekanisme biotransformasi dan oksidasi karbon tetraklorida (Timbrell, 2008)

Keracunan CCl4 pada hati diawali dengan metabolisme dehalogenasi reduktif oleh enzim sitokrom P450 (CYP2E1) menjadi suatu radikal bebas CCl3 -(triklorometil). Radikal bebas ini dapat berikatan secara kovalen dengan lemak dan protein, menyebabkan kerusakan struktur membran dan penghambatan berbagai enzim. CCl3- juga dapat bereaksi dengan O2 menghasilkan radikal bebas yang lain CCl3OO- (triklorometilperoksida) (Gambar 1). Selain itu, CCl3- dapat mengikat asam lemak enoat membentuk radikal bebas organik yang dapat bereaksi dengan O2 membentuk peroksida dan metabolit sitotoksik lainnya. Proses ini dikenal sebagai peroksidasi lemak. Penelitian menunjukkan bahwa antioksidan mengurangi sitotoksisitas CCl4 secara in vitro dan in vivo. Agen yang

menghambat pengikatan kovalen oleh CCl4 juga bersifat hepatoprotektif (Bruckner dan Warren, 2001).

Keracunan CCl4 juga ditandai oleh peningkatan kalsium (Ca2+) intraseluler. Peningkatan kadar Ca2+ berasal dari masuknya Ca2+ ektraseluler karena kerusakan membran plasma dan berkurangnya pengeluaran Ca2+ intraseluler. Peningkatan Ca2+ intraseluler dalam hepatosit dapat menyebabkan kenaikan fosfolipase A2 dan memburukkan kerusakan membran. Peningkatan Ca2+ juga berkaitan dengan perubahan kalmodulin dan aktivitas fosforilasi (Bruckner dan Warren, 2001).

Peroksidasi lipid juga dapat menyebabkan kerusakan membran sel dan kerusakan mitokondria. Kerusakan ini berupa gangguan integritas membran yang menyebabkan keluarnya berbagai isi sitoplasma, antara lain enzim ALT. Enzim ALT yang ada di dalam sel akan keluar dan masuk peredaran darah sehingga jumlah enzim ALT meningkat. Terjadinya penghambatan sintesis protein juga diakibatkan adanya gangguan keluarnya lipid dari hati yang disebabkan karena hambatan sintesis lipoprotein yang membawa trigliserida meninggalkan hati sehingga menimbulkan steatosis (perlemakan hati). Pada keadaan steatosis ini, struktur retikulum endoplasma mengalami distorsi, sintesa protein menjadi lambat, selanjutnya akan terjadi penyimpangan dengan cepat terhadap aktivitas enzim yang berada di retikulum endoplasma (Wahyuni, 2005). Tubuh manusia sebenarnya mempunyai sistem pertahanan untuk mengatasi radikal bebas, salah satunya yaitu glutation-S-transferase (GSH) yang berperan sebagai antioksidan

endogen. Jika terdapat radikal bebas di dalam tubuh, senyawa ini akan menangkap radikal bebas tersebut (Timbrell, 2008).

Peningkatan aktivitas serum ALT yang menyebabkan steatosis akibat induksi karbon tetraklorida mencapai tiga kali lipat dari kondisi normal (Tabel I) dan peningkatan aktivitas serum AST mencapai empat kali lipat dari kondisi normal (Ziemmerman, 1999). Bai, Zhang, Chen, Zong, Guo, dan Liu (2011) melaporkan adanya peningkatan aktivitas ALT kurang lebih tiga kali lipat dibanding kelompok kontrol pada tikus terinduksi karbon tetraklorida.

Tabel I. Peningkatan aktivitas enzim serum akibat induksi senyawa toksik

(Ziemmerman, 1999).

E. Pemeriksaan Biokimiawi Hati

Pemeriksaan biokimiawi mencangkup : enzim-enzim serum termasuk aminotransferase, alkaline phosphatase dan 5’-nucleotidase; produk ekskretorik seperti bilirubuin, asam-asam empedu; produk sinetik seperti albumin faktor-faktor koagulasi dan kolesterol.

Aminotransferase terdiri dari serum Alanine Aminotransferase (ALT) dan Aspartate Aminotransferase (AST) (Woodley dan Allison, 1992). Enzim ini mengkatalis transfer gugus α- amino dari alanin secara berturut-turut menjadi gugus α-keto dari ketoglutarat membentuk asam glutamat dan asam piruvat (Isselbacher dan Podolsky, 1995).

Reaksi yang terjadi :

2-oksoglutarat + L-alanin = Glutamat + Piruvat (1) Piruvat + NADH + H+ = Laktat + NADH+ (2)

Serum Alanine Aminotransferase (ALT) ditemukan secara eksklusif dalam sitosol, sedangkan isoenzim Aspartate Aminotransferase (AST) berada dalam mitokondria dan sitosol (Isselbacher dan Podolsky, 1995). Kadar yang meningkat secara mencolok (500 unit/liter) khas terdapat pada kerusakan hati akut (misalnya karena virus, obat-obatan, hepatitis karena iskhemia) sedangkan kenaikan berderajad sedang (<300 unit/liter) dapat terlihat pada berbagai keadaan (misalnya kerusakan hepatoseluler akut atau kronik, penyakit-penyakit infiltratif, obstruksi bilier). Serum ALT pada umumnya lebih spesifik daripada serum GPT untuk mendeteksi hepatitis viral (Woodley dan Allison, 1992). Kadar yang tertinggi ditemukan pada keadaan yang menyebabkan nekrosis hati yang luas, seperti hepatitis virus yang berat, cedera hati akibat toksin, atau kolaps sirkulasi yang berkepanjangan (Isselbacher dan Podolsky, 1995). Kenaikan kadar transaminase dalam serum disebabkan disebabkan oleh sel-sel yang kaya akan transaminase mengalami nekrosis atau hancur. Enzim-enzim tersebut masuk dalam peredaran darah. Kenaikan kembali atau bertahannya nilai transaminase yang tinggi biasanya menunjukkan berkembangannya kelainan dan nekrosis hati (Isselbacher dan Podolsky, 1995).

F. Kandungan Fitokimia Biji Persea americana Mill.

Biji alpukat (Persea americana Mill.) mengandung berbagai macam senyawa metabolit sekunder. Salah satunya adalah senyawa golongan fenolik.

Senyawa fenolik dapat berfungsi sebagai antioksidan karena dapat mengalami reaksi redoks, yang menyebabkan senyawa tersebut dapat berfungsi sebagai agen pereduksi, donor hidrogen, penetral radikal bebas dan pengkhelat logam.

Kulit dan biji Persea americana Mill. memiliki efek antioksidan yang cukup besar. Efek ini bergantung pada varietasnya. Ekstrak dari Persea americana tidak memiliki komponen yang toksik atau berbahaya. Metanol dapat digunakan untuk mengekstak senyawa fenolik total dengan cukup baik (Carpena

et al, 2011).

Persea americana Mill. mengandung berbagai macam senyawa fitokimia, diantaranya adalah saponin, tanin, flavonoid, sianogenik glikosida, alkaloid, fenol, steroid (Tabel II). Flavonoid merupakan senyawa poten antioksidan yang larut air dan penangkap radikal bebas. Flavonoid mencegah kerusakan oksidatif pada sel, memiliki aktivitas antikanker yang kuat, dan melindungi tubuh dengan cara melawan semua tahap karsinogenesis. Fenol juga telah diteliti secara ekstensif sebagai pencegah penyakit. Fenol yang ada pada

Persea americana memiliki kemampuan untuk digunakan sebagai anti-inflamsi, anti-penggumpalan darah, antioksidan, peningkat sistem imun dan lain sebagainya. Sedangkan alkaloid adalah metabolit sekunder yang dapat berfungsi sebagai analgesik dan memiliki efek bakterisida (Arukwe et al. 2012).

Tabel II. Kandungan fitokimia dari Persea americana pada daun, buah dan biji (Arukwe et al. 2012)

G. Sirup Curliv®Plus

Sirup Curliv® Plus merupakan suplemen untuk memproteksi hati dan membantu dalam pemulihan penyakit hati. Sirup Curliv® Plus diproduksi oleh PT. SOHO Industri Pharmasi Indonesia. Kandungan bahan sirup Curliv® Plus setiap 5 ml yaitu ekstrak Silymarin 8,75mg, ekstrak Schizandrae Fructus 33,75 mg, ekstrak Curcuma xanthorrhiza 37,5 mg, Liquiritiae Radix 33,75 mg dan vitamin B6 0,5 mg.

Silybum marianum merupakan tumbuhan yang diketahui berperan sebagai hepatoprotektor. Tumbuhan ini dilaporkan mampu melindungi hati dari berbagai jenis racun, paracetamol, alkohol, CCl4, D-galaktosamin, radiasi, penyempitan/ penyumbatan pembuluh darah yang disusul dengan nekrosis dan pengelupasan sel-sel hati, serta virus hepatitis. Mekanisme kerja silymarin sebagai hepatoprotektor berkaitan perannya sebagai antioksidan, antiperoksidasi lipid, serta meningkatkan daya detoksifikasi. Silybum marianum juga berperan dalam meningkatkan sintesis protein sel-sel hati, mengurangi aktivitas bahan-bahan yang menyebabkan tumor, memelihara sel mast (sejenis sel pada jaringan ikat yang banyak mengandung basofil, kemungkinan juga terkait dengan pembentukan histamin dan heparin), memodulasi kekebalan tubuh, antiradang dan antifibrosis (Scoot Luper, 1998).

Curcuma xanthorrhiza atau dikenal sebagai temulawak merupakan tumbuhan obat yang berasal dari Indonesia. Secara tradisional temulawak tersebut digunakan untuk pengobatan demam, jerawat, batu empedu, peningkatan produksi

ASI (Panigoro, Samsudin, Diah, 2013). Curcuma xanthorrhiza pada saat sekarang ini telah banyak diteliti terkait kandungan maupun efek farmakologinya.

Berdasarkan hasil dari beberapa penelitian dengan menggunakan hewan uji berupa tikus dan juga mencit, menunjukkan bahwa pemberian Curcuma xanthorrhiza (100 mg/kgBB) memiliki efek sebagai hepatoprotektif dengan menggunakan beberapa variasi hepatotoksin seperti karbon tetraklorida (CCl4), galaktosamin, paracetamol, dll. Melalui pengecekan gambaran histopatologis terlihat bahwa nekrosis dan kongesti vascular ditemukan lebih sedikit pada kelompok hewan uji yang diberi Curcuma xanthorriza tersebut. Efek hepatoprotektif ini dikarenakan banyaknya senyawa antioksidan di dalam

Curcuma xanthorrhiza (Committee on Herbal Medicinal Products, 2013).

Curcuminoid di dalam Curcuma xanthorrhiza memiliki khasiat sebagai antioksidan dan juga antiinflamasi. Kurkumin bertindak sebagai scavenger

terhadap spesies oksigen, seperti radikal hidroksil, anion superoksida, dan oksigen singlet dan juga menghambat peroksidasi lipid (Committee on Herbal Medicinal Products, 2013).

Schizandrae Fructus atau berasal dari tanaman Schizandrae chinesis.

Schizandrae Fructus telah banyak digunakan untuk mengobati batuk, asma, diare, insomnia dalam pengobatan dengan menggunakan obat-obatan tradisional Cina. Beberapa penelitian juga telah berhasil melakukan isolasi senyawa yang terkandung di dalam Schizandrae Fructus yang terbukti memiliki efek hepatoprotektif. Penelitian Kim, Ren, Gil, Jin, Seung, Hye, Ji, Tae, Youn (2006)

membuktikan bahwa Schizandrae Fructus memiliki aktivitas antihepatotoksik terhadap CCl4 dan galaktosamin.

H. Ekstrak

Menurut Farmakope Indonesia edisi IV, ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani atau pelikan menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetaphan (Ditjen POM, 1995).

Dalam proses ekstraksi, terjadi peristiwa difusi pelarut ke dalam sel bahan. Pelarut yang masuk ke dalam sel bahan tersebut akan melarutkan senyawa bila kelarutan senyawa yang diekstrak sama dengan pelarut. Dengan cara tersebut akan tercapai kesetimbangan antara zat terlarut dan pelarut. Pengeluaran bahan aktif dari serbuk bahan tergantung kepada laju difusi subtansi dari serbuk bahan ke dalam pelarut, waktu kontak dan laju pelarut menembus serbuk bahan (Bombardelli, 1991).

Menurut Purseglove, Brown, Green, dan Robins (1981), tahapan proses ekstraksi adalah sebagai berikut. Pertama adalah tahapan persiapan bahan dan pelarut, tahap pembuatan serbuk bahan dengan ukuran tepat sesuai keperluan ekstraksi, tahap ekstraksi dan tahap pemekatan larutan ekstrak. Menurut Bernardini (1982), ada beberapa fakor yang mempengaruhi kecepatan ekstraksi, yaitu penanganan pendahuluan, lama ekstraksi, suhu dan tipe pelarut yang digunakan. Sebelum memulai ekstraksi, dilakukan persiapan bahan baku yang mencakup pengeringan bahan sampai kadar air tertentu dan penggilingan bahan

untuk mempermudah proses ekstraksi. Selain itu, tingkat kemudahan ekstraksi bahan kering masih ditentukan oleh ukuran partikel bahan. Bahan yang akan diekstrak sebaiknya berukuran seragam untuk mempermudah kontak antara bahan dengan pelarut. Metode ekstraksi yang dilakukan tergantung pada beberapa faktor antara lain tujuan ekstraksi, skala ekstraksi, sifat komponen yang akan diekstrak, dan sifat pelarut yang digunakan. Beberapa metode umum yang biasa dilakukan adalah ekstraksi dengan pelarut, distilasi, pengepresan mekanik, dan sublimasi. Diantara metode-metode tersebut, metode yang banyak dilakukan adalah distilasi dan ekstraksi menggunakan pelarut. Prinsip ekstraksi menggunakan pelarut adalah bahan yang akan diekstrak kontak langsung dengan pelarut selama selang waktu tertentu dan komponen yang akan diekstrak akan terlarut dalam pelarut (Hougton dan Raman, 1998).

Jenis pelarut yang digunakan dalam proses ekstraksi akan mempengaruhi jenis bahan yang akan terekstrak. Kelarutan suatu senyawa dalam pelarut tergantung dari gugus-gugus yang terikat pada pelarut tersebut. Pelarut yang mempunyai gugus hidroksil (alkohol) dan karbonil (keton) termasuk pelarut polar, sedangkan hidrokarbon termasuk ke dalam non polar. Masing-masing pelarut mempunyai efesiensi yang berbeda-beda. Pemilihan pelarut harus didasarkan pada sifat polaritas, stabilitas, dan harga. Konsep like dissolves like

merupakan konsep yang menjelaskan adanya fenomena dalam proses ekstraksi, nilai kepolaran pelarut harus sedekat mungkin dengan kepolaran sampel. Konsep ini sangat berguna jika komponen yang akan diekstrak sudah diketahui kepolarannya. Pelarut etil asetat merupakan pelarut semi polar yang dapat

melarutkan alkaloid dan aglikon. Pelarut non polar akan melarutkan senyawa seperti lilin, lemak, dan terpenoid yang bersifat non polar (Houghton dan Raman, 1998).

Metanol (CH3OH) merupakan pelarut polar yang dapat bercampur dengan air, alkohol, ester, keton, eter, dan sebagian pelarut organik. Metanol sedikit larut dalam lemak dan minyak. Metanol berbentuk hablur cairan tidak berwarna, jernih, bau khas dengan berat molekul 32,04. Titik didih metanol berada pada 64,7 ºC (Ditjen POM, 1995).

I. Landasan Teori

Di dalam hati, terdapat bermacam-macam bentuk kerusakan hati. Kerusakan hati akibat induksi obat yang biasa terjadi yaitu nekrosis. Nekrosis merupakan kematian sel hati yang ditandai dengan rusaknya struktur lobulus hati. Manifestasi dari toksikan yang berbahaya dapat menimbulkan nekrosis. Perubahan biokimia yang terjadi bersifat kompleks dan berbagai hepatotoksikan bekerja melalui berbagai mekanisme. Mekanisme terjadinya nekrosis diantaranya hepatotoksikan secara kovalen mengikat protein dan lipid tidak jenuh dan menyebabkan peroksidasi lipid (Price dan Wilson, 2005).

Keracunan CCl4 pada hati diawali dengan metabolisme dehalogenasi reduktif oleh enzim sitokrom P450 menjadi suatu radikal bebas CCl3 -(triklorometil). Radikal bebas ini dapat berikatan secara kovalen dengan lemak dan protein, menyebabkan kerusakan struktur membran dan penghambatan berbagai enzim. CCl3- juga dapat bereaksi dengan O2 menghasilkan radikal bebas yang lain CCl3OO- (triklorometilperoksida). Selain itu, CCl3- dapat mengikat

asam lemak enoat membentuk radikal bebas organik yang dapat bereaksi dengan O2 membentuk peroksida dan metabolit sitotoksik lainnya. Proses ini dikenal sebagai peroksidasi lemak. Penelitian menunjukkan bahwa antioksidan mengurangi sitotoksisitas CCl4 secara in vitro dan in vivo. Agen yang menghambat pengikatan kovalen oleh CCl4 juga bersifat hepatoprotektif (Bruckner dan Warren, 2001).

Biji alpukat (Persea americana Mill.) mengandung berbagai macam senyawa metabolit sekunder. Salah satunya adalah senyawa golongan fenolik. Senyawa fenolik dapat berfungsi sebagai antioksidan karena dapat mengalami reaksi redoks, yang menyebabkan senyawa tersebut dapat berfungsi sebagai agen pereduksi, donor hidrogen, penetral radikal bebas dan pengkhelat logam. Persea americana Mill. juga mengandung berbagai macam senyawa fitokimia, diantaranya adalah tanin, flavonoid, alkaloid dan fenol. Flavonoid merupakan senyawa poten antioksidan yang larut air dan penangkap radikal bebas. Flavonoid mencegah kerusakan oksidatif pada sel, memiliki aktivitas antikanker yang kuat, dan melindungi tubuh dengan cara melawan semua tahap karsinogenesis. (Arukwe et al, 2012).

Pada penelitian ini digunakan ekstrak metanol biji Persea americana.

Pemilihan ekstrak metanol berdasarkan penelitian sebelumnya. Pada penelitian efek antioksidan biji alpukat (Persea americana Mill.) telah diketahui bahwa senyawa fenolik yang berkhasiat sebagai antioksidan dapat terambil dengan baik dari biji Persea americana Mill. dengan menggunakan pelarut metanol (Carpena, Morcuende, Andrade, Kylli dan Estevez, 2011)

J. Hipotesis

Ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. memiliki efek hepatoprotektif pada tikus jantan terinduksi karbontetraklorida.

27 BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah.

B. Variabel dan Definisi Variabel Utama 1. Variabel utama :

a. Variabel bebas. Variabel bebas dari penelitian ini adalah variasi dosis pemberian ekstrak metanol Persea americana Mill. ( biji buah alpukat ). Dosis ekstrak metanol Persea americana Mill. adalah sejumlah (gram) ekstrak metanol Persea americana Mill. tiap satuan kilogram berat badan subjek uji yang bersangkutan.

b. Variabel tergantung. Variabel tergantung dari penelitian ini adalah efek hepatoprotektif ekstrak metanol Persea americana Mill. secara jangka panjang terhadap sel hati tikus terinduksi CCl4, ditandai dengan tolok ukur kuantitatif berupa penurunan aktifitas Alanine Aminotransferase (ALT) dan Aspartate Transaminase (AST).

2. Variabel pengacau terkendali

Hewan uji tikus jantan galur Wistar, berat badan 150-250 gram, umur antara 2-3 bulan.

a. Frekuensi pemberian ekstrak metanol Persea americana Mill. 1 kali sehari selama 6 hari berturut-turut dengan waktu pemberian yang sama.

b.Cara pemberian ekstrak dilakukan secara per oral (p.o).

c. Bahan uji yang digunakan berupa biji Persea americana Mill. yang diperoleh dari Padang, Sumatra Barat.

3. Variabel pengacau tak terkendali Kondisi patologis hewan uji 4. Definisi operasional

Definisi operasional yang digunakan pada penelitian ini yaitu :

a. Ekstrak metanol biji Persea americana Mill. adalah ekstrak kental yang diperoleh dengan mengekstraksi serbuk kering biji Persea americana Mill. seberat 10,0 gram yang dilarutkan dalam 100 ml pelarut metanol 70% yang dikeringkan hingga bobot tetap.

b. Efek hepatoprotektif adalah kemampuan ekstrak metanol biji Persea americana Mill. pada dosis tertentu dapat melindungi hepar dari hepatotoksin.

c. Dosis optimum adalah dosis yang mampu memberikan % efek hepatoprotektif dan % daya hepatoprotektif paling optimal.

d. Jangka panjang adalah penetapan lama pemejanan ekstrak metanol-air biji

Persea americana Mill. selama enam hari dan pada hari ke 7 diberi karbon tetraklorida dosis 2 ml/kgBB.

C. Subyek dan Bahan Penelitian 1. Subyek penelitian

Subyek uji yang digunakan berupa tikus jantan galur Wistar, umur 2-3 bulan dengan berkisar antara 150-250 gram, diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Bahan penelitian

a. Bahan uji adalah simplisia biji buah alpukat (Persea americana Mill.) yang berupa serbuk. Bahan uji diperoleh dari kawasan Sumatera Barat yang telah diserbukkan, dideterminasi serta ditetapkan kadar airnya.

b. Bahan hepatotoksik adalah larutan CCl4 (E. Merck, Darmstadt, Germany) yang dilarutkan dalam Olive Oil (merek dagang Bartoli) yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Konsentrasi karbon tetraklorida yang digunakan adalah 50% dengan dosis 2 ml/kgBB.

c. Bahan pelarut aquadest diperoleh dari Laboratorium Farmakologi Toksikologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. d. Bahan pengektrak serbuk biji alpukat yaitu metanol teknis (PT. Brataco)

dengan konsentrasi 99% yang diencerkan hingga konsentrasi 70% menggunakan pengencer aquadest.

e. Penetapan aktivitas ALT digunakan pereaksi siap pakai kit GPT-ALAT (E. Merck, Darmstadt, Germany) untuk mengukur aktivitas ALT serum. Masing-masing bahan terdiri atas dua reagen yaitu Reagen 1 dan Reagen 2.

GPT-ALAT :

R1 TRIS pH 7.15 140 mmol/L

L-Alanine 700 mmol/L

LDH (Lactate dehydrogenase) ≥2300 U/L

R2 2-Oxoglutarate 85 mmol/L

NADH 1 mmol/L

Pyridoxal-5-phosphate FS :

Good’s buffer pH 9.6 100mmol/L

Pyridoxal-5-phosphate 13mmol/L

f. Aquabidest digunakan sebagai pencuci vitalab mikro dan juga sebagai blanko dalam pengukuran aktvitas kreatinin serum. Aquabidest ini diperoleh dari laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

g. Natrium-Carboxymethyl Cellulosa (CMC-Na). CMC-Na yang digunakan dalam bentuk serbuk, diperoleh dari laboratorium Biofarmasetika Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta

D. Alat dan Instrumen Penelitian Alat-alat yang dipakai meliputi :

1. Seperangkat alat gelas berupa bekker glass, erlenmeyer, gelas ukur, labu ukur, cawan porselen, pipet tetes, batang pengaduk (Pyrek Iwaki) 2. Timbangan analitik

3. Shaker

5. Sentrifuge 6. Vortex

7. Spuit per oral dan syringe 3 cc 8. Pipa kapiler

9. Vitalab micro (Microlab 200, Merck) 10. Kamera (Canon 5D)

E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi serbuk Persea americana Mill.

Determinasi serbuk biji tanaman Persea americana Mill. dilakukan dengan mencocokan ciri-ciri tanaman Persea americana Mill. dengan serbuk biji tanaman Persea Americana Mill. yang telah dideterminasi dengan menggunakan buku acuan determinasi. Determinasi dilakukan secara makroskopis termasuk organoleptis serbuk dan secara mikroskopis. Determinasi dilakukan oleh Yohanes Dwiatmaka, M.Si yang merupakan dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Pengumpulan bahan

Bahan uji yang digunakan adalah biji Persea americana Mill. yang masih segar, diperoleh dari Sumatera Barat pada bulan Januari (musin penghujan). 3. Pembuatan serbuk

Biji Persea americana Mill. dicuci bersih dibawah air mengalir. Setelah bersih, biji kemudian dikering anginkan hingga biji tidak tampak basah lagi, kemudian biji Persea americana Mill. dipotong tipis-tipis dan dikeringan di dalam oven pada suhu 500 C selama 24 jam untuk mengoptimalkan proses

pengeringan. Setelah kering, biji diserbukkan dan diayak dengan ayakan nomor 40. Pengayakan dilakukan agar kandungan fitokimia yang terkandung dalam biji

Persea americana Mill. lebih mudah tersekstrak karena luas permukaan spesifik yang kontak dengan pelarut semakin besar.

4. Pembuatan ekstrak metanol biji Persea americana Mill.

Sebanyak 10 gram serbuk kering biji Persea americana Mill. diekstraksi dengan cara maserasi. Serbuk dilarutkan dalam 100 ml pelarut metanol 70% di dalam Erlenmeyer bersumbat kaca. Ekstraksi dilakukan pada suhu kamar. Perbandingan jumlah serbuk dan pelarut adalah 1:10. Campuran serbuk dan pelarut kemudian digojong selama 1 menit, didiamkan dalam ruangan gelap dan ditutup. Setiap harinya selama 5 hari berturut-turut pada jam yang sama dilakukan penggojogan selama 1 menit. Kemudian dilakukan penyaringan dengan kertas saring dengan bantuan pompa vakum. Ekstrak kemudian diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 70 0C hingga tidak ada lagi tetesan pada rotary evaporator. Hasilnya kemudian dipindahkan ke dalam cawan porselen yang telah ditimbang bobotnya terlebih dahulu. Selanjutnya, dipekatkan dengan menggunakan penangas air pada suhu 70 0C. dilakukan penimbangan setiap harinya hingga bobot ekstrak tetap (selisih penimbangan < 0,5 mg tiap gram zat sisa dari 2 penimbangan berturut-turut). Kemudian ekstrak disimpan di dalam desikator hingga saat akan digunakan.

5. Pembuatan larutan Natrium-Carboxy Methyl Cellulosa (CMC-Na) 1% Larutan CMC-Na 1% dibuat dengan cara menimbang 5,0 g CMC-Na serbuk yang telah digerus dalam mortar dan stamper terlebih dahulu. Serbuk

kemudian ditaburan secara merata di permukaan 200 mL aquadest di dalam gelas kimia dan ditunggu hingga semua serbuk terbasahi, tanpa pengadukan. Setelah semua serbuk CMC-Na terbasahi maka dilakukan pengadukan hingga seluruh CMC-Na larut. Larutan CMC-Na kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 500 ml dan ditambahkan aquadest hingga batas tanda.

6. Pembuatan suspensi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dalam CMC-Na 1%

Suspensi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dibuat dengan konsentrasi 7%. Sebanyak 3,5 g ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. ditimbang secara seksama. Kemudian dilarutkan dengan menggunakan larutan CMC-Na 1% hingga terlarut keseluruhan dan dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL dan ditambah dengan larutan CMC-Na 1% hingga batas tanda, selanjutnya digojog hingga homogen.

7. Pembuatan larutan karbon tetraklorida (CCl4) konsentrasi 50%

Larutan CCl4 dalam Olive Oil dibuat dengan cara melarutkan 25 ml CCl4 dalam labu takar 50 ml kemudian ditambahkan dengan Olive Oil hingga tanda. Digojog hingga homogen. Pengambilan CCl4 dilakukan dengan menggunakan pipet gondok 25 ml.

8. Penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill.

Penetapan kadar air dilakukan dengan cara menimbang sebanyak 5,0 g serbuk biji Persea americana Mill. dan kemudian serbuk tersebut dimasukkan ke dalam alat moisture balance selama 15 menit pada suhu 105°C. Perhitungan kadar air berdasarkan selisih bobot sebelum serbuk dimasukkan ke dalam alat moisture

balance dengan sesudah serbuk dimasukkan ke dalam alat moisture balance. Selisih bobot inilah yang merupakan kadar air dari serbuk biji Persea americana

Mill.

9. Penetapan konsentrasi ekstrak pekat

Rata-rata bobot ke enam replikasi ekstrak metanol biji Persea americana

Mill. kental yang telah dibuat.

Bobot ekstrak = berat cawan ekstrak kental – berat cawan kosong. Rata- rata bobot ekstrak =

Konsentrasi ekstrak didapat dari hasil rata-rata bobot ekstrak. Konsentrasi yang digunakan adalah konsentrasi pekat yang dapat dibuat. Pada konsentrasi yang digunakan tersebut ekstrak dapat dimasukkan dan dikeluarkan dari spuit oral . Cara pembuatannya adalah dengan melarutkan ekstrak setiap cawan dalam labu ukur 5 ml dengan pelarut yang sesuai (CMC Na 1%). Sehingga konsentrasi ekstrak dapat ditetapkan.

10. Uji pendahuluan

a. Penetapan dosis hepatoprotektif CCl4

Pemilihan dosis CCl4 dilakukan untuk mengetahui pada dosis berapa CCl4 mampu menyebabkan kerusakan pada hati tikus yang ditandai dengan peningkatan serum ALT paling tinggi. Dosis hepatotoksik yang digunakan dalam penelitian ini berdasarkan pada hasil orientasi yang sedang dilakukan sehingga nantinya bisa didapat dosis yang mampu meningkatkan aktivitas ALT serum pada tikus bila diberikan secara per oral.

b. Penetapan waktu cuplikan darah

Kenaikan serum ALT akan terjadi pada waktu 24-48 jam setelah pemejanan CCl4. Untuk mendapatkan waktu pencuplikan darah dilakukan orientasi dengan 4 kelompok perlakuan waktu. Masing-masing kelompok sejumlah 3 ekor tikus. Kelompok I diambil darah pada jm ke-0 setelah pemejanan CCl4, kelompok II diambil darah pada jam ke-24 setelah pemejanan CCl4, kelompok III diambil darah pada jam ke-48 dan keompok IV diambil darah pada jam ke-72 setelah pemejanan CCl4. Setelah pengambilan darah, darah diukur aktivitas serum ALT dan ditentukan waktu optimal pengukuran cuplikan darah berdasarkan data serum ALT.

c. Penetapan lama pemejanan ekstrak metanol biji Persea americana Mill. Lama waktu pemejanan ekstrak metanol biji Persea americana Mill dilakukan selama 6 hari berturut-turut, pada hari ketujuh dipejankan senyawa hepatotoksin dan diukur aktivitas ALT-nya setelah 24 jam pemejanan senyawa hepatotoksin.

11.Pengelompokan dan perlakuan hewan uji

Sejumlah tiga puluh lima ekor tikus dibagi secara acak ke dalam tujuh kelompok perlakuan masing-masing sejumlah 5 ekor. Kelompok I (kontrol hepatotoksin) diberi larutan CCl4 secara intraperitonial. Kelompok II (kontrol negatif) diberi minyak zaitun (Olive Oil) dosis 3,84 g/Kg BB selama 6 hari berturut-turut secara intrapenitonial. Kelompok III (kontrol ekstrak biji Persea americana Mill.) dengan dosis 1400mg/kgBB selama 6 hari berturut-turut secara intrapenitonial. Kelompok IV (kontrol positif) diberi Curliv® 4,05 ml/kgBB

selama enam hari berturut-turut secara peroral. Kelompok V sampai dengan kelompok VII berturut-turut diberi ekstrak metanol biji Persea americana Mill dengan dosis 1400; 700; dan 350 mg/kgBB selama 6 hari berturut-turut secara peroral. Kemudian pada hari ketujuh semua kelompok perlakuan diberi larutan CCl4 dosis tertentu secara intraperitonial setelah 24 jam diambil darahnya melalui sinus orbitalis mata. Cuplikan darah diambil serumnya untuk aktivitas ALT serumnya.

12.Pembuatan serum

Darah tikus diambil melalui sinus orbitalis mata dan ditampung dalam effendrof 1,5 ml melalui dinding tabung, didiamkan selama 15 menit. Dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 15 menit dan diambil supernatannya (serum). Supernatan ditampung dalam effendrof 1,5 mL. Serum yang belum diukur kemudian disimpan dalam lemari pembeku (Freezer).

13.Penetapan aktivitas serum ALT dan serum AST

Alat yang digunakan untuk menganalisis aktivitas ALT-AST serum adalah vitalab mikro. Aktivitas enzim diukur pada panjang gelombang 340 nm, suhu 370 C dengan faktor koreksi -1745. Aktivitas serum ALT-AST dinyatakan dalam U/L. Pengukuran aktivitas serum ALT-AST dilakukan di laboratorium Biokimia, Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Analisis dilakukan dengan cara sebagai berikut, 100 μL serum dicampur dengan reagen I sebanyak 1000 µL, divortex selama 5 detik. Didiamkan selama 1 menit. Reagen II ditambahkan sebanyak 250 μL, divortex 5 detik dan dibaca serapannya setelah 2 menit.

F. Tata Cara Analisis Hasil

Data aktivitas ALT diuji dengan Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui distribusi data dan analisis varian untuk melihat homogenitas varian antar kelompoknya sebagai syarat analisis parametrik. Jika data terdistribusi normal maka dilanjutkan dengan analisis variansi pola searah (One Way ANOVA) dengan taraf kepercayaan 95% untuk mengetahui perbedaan masing-masing kelompok. Kemudian dilanjutkan dengan uji LSD untuk melihat perbedaan antar kelompok bermakna (signifikan) (p<0,05) atau tidak bermakna signifikan (p>0,05). Tetapi apabila distribusi tidak normal dilakukan analisis dengan Kruskal Wallis untuk mengetahui perbedaan aktivitas ALT serum antar kelompok. Kemudian dilanjutkan Mann Whitney untuk melihat perbedaan tiap kelompok.

Data derajat kerusakan hati juga dianalisis sesuai prosedur diatas dengan taraf kepercayaan 95%. Perhitungan persen efek hepatoprotektif terhadap hepatotoksin CCl4 dilakukan dengan rumus :

38 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian dan besar dosis optimum hepatoprotektif ekstrak metanol air biji alpukat (Persea americana

Mill.) pada tikus jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida dengan melihat penurunan aktivitas serum ALT dan serum AST.

Pengamatan hasil penelitian ini dapat tercapai dengan penelitian meliputi determinasi tanaman biji alpukat (Persea americana Mill.), penetapan kadar air serbuk kering biji alpukat (Persea americana Mill.), penentuan dosis hepatotoksin karbon tetraklorida, penentuan waktu pencuplikan darah hewan uji, uji kontrol negatif olive oil, uji kontrol positif obat Curliv®, uji efek hepatoprotektif ekstrak metanol air biji Persea americana Mill. dosis 1400; 700; dan 350 mg/kgBB.

A. Penyiapan Bahan 1. Determinasi serbuk

Pada penelitian ini digunakan serbuk biji Persea americana Mill. sebagai bahan uji. Determinasi serbuk dilakukan dengan tujuan untuk membuktikan bahwa serbuk yang digunakan benar merupakan bagian biji dari tanaman Persea americana Mill. sehingga tidak terjadi kesalahan dalam penyiapan bahan yang digunakan. Determinasi dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Determinasi dilakukan dengan cara mencocokkan kesamaan ciri dari serbuk biji yang digunakan pada penelitian dengan serbuk biji Persea americana Mill. yang telah dideterminasi

Maka perhitungan daya hepatoprotektif ALT serum sebagai berikut :

 Kelompok perlakuan ekstrak metanol biji Persea americana Mill. dosis 1400 mg/kgBB + induksi karbon tetraklorida 2 ml/kgBB :

 Kelompok perlakuan ekstrak metanol biji Persea americana Mill. dosis 700 mg/kgBB + induksi karbon tetraklorida 2 ml/kgBB :

 Kelompok perlakuan ekstrak metanol biji Persea americana Mill. dosis 350 mg/kgBB + induksi karbon tetraklorida 2 ml/kgBB :

Lampiran 13. Perhitungan penetapan peringkat dosis ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. kelompok perlakuan

Dasar penetapan peringkat dosis:

 Bobot tertinggi tikus = 250 g = 0,25 kg

 Konsentrasi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. yang digunakan 7% = 70 mg/mL.

 Pemberian cairan secara per oral maksimal 5 ml

Dengan dasar tersebut maka ditetapkan dosis tertinggi dengan rumus :

V x C = BB x D Keterangan :

V = volume pemberian (mL) C = konsentrasi (mg/mL)

BB = Berat badan (kg) D = Dosis (mg/kg)

Volume Pemberian x Konsentrasi = Berat badan x Dosis 5 mL x 70 mg/mL = 0,25 kg x Dosis

Dosis = 1400 mg/kgBB (dosis tertinggi)

Untuk dua peringkat dosis di bawahnya, dosis tertinggi ini dibagi 2 kemudian dibagi 2 lagi sehingga diperoleh 3 peringkat dosis : 1400 (dosis I), 700 (dosis II) dan 350 (dosis III) mg/kgBB.

Lampiran 14. Perhitungan konversi dosis untuk manusia  Angka konversi Tikus 200 g ke Manusia 70 kg = 56,0

 Dosis untuk manusia = Dosis untuk tikus 200 g x (angka konversi ke manusia)

Maka ditetapkan dosis ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill.: 1. Dosis I (1400 mg/kgBB tikus) ekstrak metanol-air biji Persea americana :

1400 mg/kgBB = 280 mg/200 gBB

280 mg/200 gBB x 56,0 = 15680 mg/70 kgBB manusia = 15,68 g/70 kgBB manusia

2. Dosis II (700 mg/kgBB tikus) ekstrak metanol-air biji Persea americana : 700 mg/kgBB = 140 mg/200 gBB

140 m g/200 gBB x 56,0 = 7840 mg/70 kgBB manusia = 7,84 g/70 kgBB manusia

3. Dosis III (350 mg/kgBB tikus) ekstrak metanol-air biji Persea americana : 350 mg/kgBB = 70 mg/200 gBB

70 mg/200 gBB x 56,0 = 3920 mg/70 kgBB manusia = 3,92 g/70 kgBB manusia Lampiran 15. Perhitungan konversi hari untuk manusia  1 Bulan untuk tikus = 34 bulan untuk manusia

Maka 1 hari untuk tikus = 34 hari untuk manusia 6 hari untuk tiikus = 204 hari untuk manusia

Lampiran 16. Penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill. Penetapan kadar air dilakukan menggunakan alat moisture balance dengan metode Gravimetri. Pemanasan serbuk biji Persea americana Mill. dilakukan pada suhu 105 0C selama 15 menit.

Tabel XI. Hasil penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill. Bobot Replikasi I Replikasi II Replikasi III Sebelum

pemanasan

5,000 g 5,000 g 5,000 g Sesudah

pemanasan

4,624 g 4,636 g 4,630 g

Kadar air 7,52 % 7,28 % 7,40%

Rata-rata kadar air 7,40 %

Kadar air =

Replikasi 1 =

7,52 % Replikasi 2 =

7,28 % Replikasi 3 =

7,40 %

Lampiran 17. Hasil rendemen ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill.

Tabel XII. Hasil rendemen ekstrak metanol-air Biji Persea americana Mill. Keterangan (gram) Cawan 1 Cawan 2 Cawan 3 Cawan 4 Cawan 5 Cawan kosong 63,29 66,22 47,06 53,57 50,5 Cawan + ekstrak 66,18 69,09 49,93 56,31 53,03

% Rendemen ekstrak kental =

x 100% = 26,55%

Jumlah serbuk yang digunakan untuk pembuatan ekstrak kental sebanyak 200 g serbuk kering biji Persea americana Mill., pada tiap cawannya digunakan 10 g serbuk kering dalam 100 mL pelarut metanol-air 70%. Rata-rata rendemen setiap 10 g serbuk kering adalah sebesar 2,78 gram ekstrak kental. Pada pembuatan 200 g serbuk kering biji Persea americana Mill.menghasilkan 53,1 g ekstrak kental, dengan % rendemen 26,55 %.

Lampiran 18. Bobot pengeringan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill.

Tabel XIII. Bobot pengeringan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill.

Cawan Berat cawan kosong (gram)

Jam ke 0 08.00

1 09.00

2 10.00

3 11.00

4 12.00

5 13.00

1 63,29 Berat

ekstrak (g)

101,00 82,11 70,09 66,42 66,18 66,18 2 66,22 97,61 85,90 75,30 70,03 69,09 69,09 3 47,06 80,52 70,65 57,23 50,11 49,93 49,93

Lampiran 19. Hasil pengukuran validitas dan reabilitas

Tabel XIV. Hasil validitas dan reabilitas pengukuran ALT dilihat dari serum kontrol (range 26,2 – 41,8 U/L)

x ( U/L ) x - (x - )2

30

30,6

0,6 0,36

31 0,4 0,16

31 0,4 0,16

31 0,4 0,16

30 0,6 0,36

SD = √∑ ̄ SD = √ = 0,3

Range x D = 30,6 0,3

= 29,4 – 31,8

CV =

x 100%

=

Tabel XV. Hasil validitas dan reabilitas pengukuran AST dilihat dari serum kontrol (range 35,4-56,6 U/L)

x ( U/L ) x - (x - )2

39

38,8

0,2 0,04

39 0,2 0,04

39 0,2 0,04

38 0,8 0,64

39 0,2 0,04

∑ 0,8

SD = √∑ ̄ SD = √ = 0,2

Range x D = 3 , 0,2

= 38,6 – 39,0

CV =

x 100%

=

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “Efek Hepatoprotektif Jangka Panjang Ekstrak Metanol-Air BijiPersea Americana Mill. Terhadap Aktivitas ALT-AST Serum Pada Tikus Jantan Wistar Terinduksi Karbon Tetraklorida” memiliki nama lengkap Robert Dwijantara Putra. Penulis lahir di Yogyakarta pada tanggal 02 Mei 1992, merupakan putra kedua dari empat bersaudara dalam keluarga pasangan Budi Kasno dan Nastiti Handayani. Penulis mengawali pendidikan di TK Kanisius Demangan Baru Yogyakarta (1997-1998) kemudian melanjutkan pendidikan tingkat Sekolah Dasar di SD Kanisius Demangan Baru Yogyakarta (1998-2004). Pendidikan Sekolah Menengah Pertama ditempuh oleh penulis di SMP Negeri 6 Yogyakarta (2004-2007), kemudian melanjutkan pendidikan Sekolah Menengah Atas di SMA Bopkri 1 Yogyakarta (2007-2010). Penulis kemudian melanjutkan pendidikan sarjana di Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2010. Semasa menempuh kuliah, penulis aktif dalam beberapa kegiatan kepanitiaan dan organisasi antara lain sebagai anggota Unit Kegiatan Fakultas Bidang Olahraga Badminton (2012-2013), anggota PosKes Kota Baru (2010 - sekarang). Penulis pernah menjadi volunteer PIO ISMAFARSI (2011), anggota divisi Perlengkapan Pelepasan Wisuda Fakultas Farmasi (2012), koordinator Perlengkapan TITRASI (2012). Penulis pernah menjadi asisten praktikum Farmakologi Toksikologi (2013).