Efek nefroprotektif jangka pendek ekstrak metanol-air biji persea americana mill. terhadap kadar kreatinin dan gambaran histologis ginjal tikus jantan wistar terinduksi karbon tetraklorida.

INTISARI

Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan informasi tentang efek nefroprotektif ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. pada dosis 350 mg/kgBB secara jangka pendek pada waktu pemberian 1, 4 dan 6 jam sebelum pemejanan karbon tetraklorida (CCl4) dosis 2 mL/kgBB konsentrasi 50% v/v dan

juga mengetahui waktu efektif pemberian ekstrak untuk digunakan sebagai nefroprotektor.

Penelitian bersifat eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah. Hewan uji yang digunakan adalah tikus putih jantan galur Wistar umur 2-3 bulan dengan berat 150-250 gram. Terdapat 6 kelompok pada penelitian, yaitu kelompok I yang merupakan kelompok kontrol nefrotoksin CCl4

2 mL/kgBB, kelompok II adalah kelompok kontrol negatif olive oil 2 mL/kgBB. Olive oil pada penelitian digunakan sebagai pelarut CCl4. Kelompok III

merupakan kelompok kontrol ekstrak dosis 350 mg/kgBB. Kelompok IV, V, dan VI secara berturut-turut adalah kelompok perlakuan 1, 4, 6 jam pemberian ekstrak dosis 350 mg/kgBB sebelum pemejanan CCl4. Jumlah tikus yang digunakan untuk

setiap kelompok adalah 5 ekor. Pengecekan dilakukan dengan mengukur kadar kreatinin serum pada waktu pencuplikan darah optimal yaitu pada 48 jam setelah pemejanan atau induksi CCl4. Metode analisis statistic dilakukan dengan

menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov, Levene test, uji t-berpasangan, One way ANOVA dan uji Scheffe.

Berdasarkan data yang diperoleh, ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dosis 350 mg/kgBB terbukti memiliki khasiat nefroprotektif pada tikus jantan Wistar terinduksi CCl4 2 mL/kgBB secara jangka pendek. Waktu

efektif pemberian ekstrak untuk memberikan efek nefroprotektif berdasarkan data penurunan kadar kreatinin serum diketahui pada 1 jam sebelum pemejanan CCl4

dengan % efek nefroprotektif sebesar 90,5%.

Kata kunci : Biji Persea americana Mill., ekstrak metanol-air, nefroprotektif, jangka pendek, karbon tetraklorida

ABSTRACT

This study aimed to obtain information about the effects of methanol-water seed extract of Persea americana Mill. seed as nephroprotective agent at dose 350 mg/kgBW in short term 1, 4 and 6 hours administration of extract before exposured to carbon tetrachloride (CCl4) 50% v/v at dose of 2 mL/kgBW and also

determined the effective time of extract as nephroprotective agent.

This study was experimentally pure with direct sampling design. This study used male Wistar rats aged 2-3 months and weight 150-250 g. There are 6 groups in this study, group I was nephrotoxins CCl4 2 mL/kgBW control group,

group II was the negative control group (olive oil) 2 mL/kgBW. Olive oil was used as solvent of CCl4. Group III was extract control group at dose 350

mg/kgBW. While groups IV, V, and VI respectively were treated group 1, 4, 6 hours administration of extract at dose 350 mg/kgBB before exposure to CCl4.

Each group used 5 rats. The test was done by measuring serum creatinine concentration at the optimum time of blood sampling (48 hours after CCl4

exposure). Statistical analysis was performed using the Kolmogorov-Smirnov test, Levene's test, Paired t-Test, One-way ANOVA and Scheffe test.

Based on the data that obtained, the methanol-water extract of Persea americana Mill. seed at dose of 350 mg/kgBW gave nephroprotective effect in male Wistar rats induced by CCl4 2 mL/kgBW in the short term. Effective time of

administration of extract as nephroprotective agent based on the data of serum creatinine concentration was 1 hour before CCl4 exposure with 90.5%

nephroprotective effect.

Keywords: Persea americana Mill. seed, Methanol-water extracts, nephroprotective, short-term, carbon tetrachloride

i

EFEKNEFROPROTEKTIFJANGKAPENDEK

EKSTRAKMETANOL-AIRBIJIPersea americana Mill. TERHADAP

KADAR KREATININ DAN GAMBARAN HISTOLOGIS GINJAL TIKUS JANTAN WISTAR TERINDUKSI KARBON TETRAKLORIDA

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Diajukan Oleh: Liana Risha Gunawan

NIM : 108114039

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

HALAMAN PERSEMBAHAN

Aku bersyukur kepada-Mu oleh karena kejadianku dahsyat dan ajaib

(Mazmur 139 : 14a)

Kupersembahkan karyaku ini untuk : Tuhan Yesusku, Bapa yang senantiasa menopangku dan mengangkatku saat kuterjatuh serta memberiku kekuatan. Ayah, Ibu dan Kakak tercinta atas segala doa, cinta dan perhatiannya. Sahabat-sahabatku tersayang Almamaterku

Ketika kaki sudah tidak kuat berdiri : “BERLUTUTLAH”

Ketika Tangan sudah tidak kuat menggenggam : “LIPATLAH”

Ketika kepala sudah tidak kuat ditegakkan : ”MENUNDUKLAH” Ketika hati sudah tidak kuat menahan kesedihan : “MENANGISLAH” Ketika hidup sudah tidak mampu untuk dihadapi : “BERDOALAH”

Di dalam setiap masalah : Ingatlah TUHAN YESUS selalu setia bersama kita”.

vii PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Kasih atas berkat yang tiada henti, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi berjudul “EFEK

NEFROPROTEKTIFJANGKAPENDEKEKSTRAKMETANOL-AIRBIJI

Persea americana Mill. TERHADAP KADAR KREATININ DAN

GAMBARAN HISTOLOGIS GINJAL TIKUS JANTAN WISTAR

TERINDUKSI KARBON TETRAKLORIDA” dengan baik.

Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) program studi Farmasi Universitas Sanata Dharma.

Penulis menyadari bahwa dalam pelaksanaan dan penyusunan skripsi ini tentunya tidak lepas dari bantuan dan campur tangan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih pada :

1. Ibu Phebe Hendra, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dosen Pembimbing skripsi atas segala kesabaran dalam membimbing, memberi masukan dan motivasi kepada penulis selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.

2. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt., selaku Dosen Penguji skripsi atas bantuan dan masukkan demi kemajuan skripsi ini.

3. Bapak Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt. selaku Dosen Penguji skripsi atas bantuan dan masukkan demi kemajuan skripsi ini.

4. Ibu Rini Dwiastuti, M.Si., Apt. selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah memberikan ijin dalam penggunaan fasilitas laboratorium untuk kepentingan penelitian ini.

5. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., yang telah memberikan bantuan dalam deteminasi serbuk biji Persea americana Mill.

6. Ibu drh. Ari selaku dokter hewan di laboratorium Imono yang telah membantu dengan sabar dalam menyediakan hewan uji untuk penelitian ini.

7. Bapak Heru, Bapak Suparjiman dan Pak Kayatno selaku laboran bagian Farmakologi dan Toksikologi, Pak Wagiran selaku laboran Farmakognosi Fitokimia atas segala bantuan dalam pelaksanaan skripsi ini.

8. Keluarga terkasih, papa, mama dan kak Evan yang tidak pernah berhenti memberikan dukungan, perhatian, saran selama ini.

9. Robert Dwijantara Putra atas semua bantuan, saran, dukungan dan perhatian dalam segala hal selama ini baik dalam suka maupun duka.

10.“Tim Persea americana” Priscilla, Dara, Rotua, Ayu, Dian, Lydia, Ike kumala, Inneke, Irene, Yuditha, Ita, Angel, Dion atas semua bantuannya

11.Teman-teman Farmasi angkatan 2010, Ita, Ocha, Via, Juli, Cilla, teman-teman kos Agatha dan semua pihak yang turut membantu.

Penulis ini menyadari bahwa tugas akhir ini belum sempurna dan masih banyak kekurangan sehingga penulis berharap kritik dan saran yang membangun dari semua pihak. Akhir kata, penulis berharap semoga tugas akhir ini dapat bermanfaat bagi semua pihak terutama di bidang ilmu farmasi.

Yogyakarta, November 2013

ix DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ……… i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ……….. ii

HALAMAN PENGESAHAN ……….…. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ……….……...……….. iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ……….……….. v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ……….……… vi

PRAKATA ……….……... vii

DAFTAR ISI ……….……… ix

DAFTAR TABEL ……….……… xiv

DAFTAR GAMBAR ……… xvi

DAFTAR LAMPIRAN ………. xviii

INTISARI ……….……. xx

ABSTRACT ……….…….………..……… xxi

BAB I. PENGANTAR ……….. 1

A. Latar Belakang ………. 1

1. Perumusan masalah ……….. 3

2. Keaslian penelitian ……… 4

3. Manfaat penelitian ……… 5

B. Tujuan Penelitian ……….. 5

1. Tujuan umum ………... 5

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ………... 6

A. Taksonomi dan Morfologi Alpukat ( Persea americana Mill. ) ……….. 6

B. Kandungan Fitokimia Biji Persea americana Mill. ……….... 7

C. Ginjal ………. 9

1. Fungsi ginjal ……….. 9

2. Anatomi dan fisiologi ginjal ……….………. 11

D. Gangguan Sistem Urinaria ……….………... 17

1. Pielonefritis dan infeksi saluran kemih ………. 17

2. Gagal ginjal ……… 17

3. Nekrosis tubular akut ……… 18

E. Kreatinin ………./………. 19

F. Karbon Tetraklorida (CCl4) ……..….…..……… 21

G. Ekstraksi ………... 22

H. Landasan Teori ………. 23

I. Hipotesis ………. 24

BAB III. METODE PENELITIAN ………... 25

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ……… 25

B. Variabel dan Definisi Operasional ……….. 25

1. Variabel utama ……….. 25

2. Variabel pengacau terkendali ……… 25

C. Subyek dan Bahan Penelitian ……….. 27

1. Subyek penelitian ………. 27

xi

2. Bahan penelitian ………... 27

D. Alat dan Instrumen Penelitian ………. 28

E. Tata Cara Penelitian ………. 29

1. Determinasi serbuk biji Persea americana Mill. ……… 29

2. Pengumpulan bahan ………. 29

4. Pembuatan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. ….. 30

5. Penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill. ………. 31

6. Pembuatan larutan Natrium-Carboxy Methyl Cellulosa (CMC-Na) 1% ……….. 31

7. Pembuatan suspensi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dalam CMC-Na 1% ……….. 31

8. Pembuatan larutan karbon tetraklorida (CCl4) konsentrasi 50% 32 9. Uji pendahuluan ……… 32

10. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji ……….. 33

11. Pembuatan serum ……… 33

12. Penetapan kadar kreatinin serum ……… 34

13. Pembuatan formalin 10% ……… 34

14. Pencuplikan organ ginjal tikus untuk pengamatan gambaran histologis ………. 34

F. Tata Cara Analisis Hasil ……… 35

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ………. 36

A. Penyiapan Bahan ……….. 36

1. Hasil determinasi serbuk biji Persea americana Mill. ………… 36 2. Penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill. ………. 36 3. Hasil penimbangan bobot ekstrak metanol-air biji Persea americana

Mill. ……….. 37

B. Uji Pendahuluan ……….. 38 1. Penentuan dosis nefrotoksin karbon tetraklorida …...…………. 38 2. Penentuan waktu pencuplikan darah ………... 39 3. Penetapan lama pemejanan ekstrak metanol-air biji Persea

americana Mill. dosis 350 mg/kgBB ……….……….………… 42 4. Penetapan dosis ekstrak metanol-air Biji Persea americana Mill. 43 C. Hasil Uji Waktu Nefroprotektitf Ekstrak Metanol-Air biji Persea

americana Mill. ….………... 44 1. Kontrol negatif olive oil dosis 2 mL/kgBB ………... 46 2. Kontrol nefrotoksin (karbon tetraklorida dosis 2 mL/kgBB) …... 48 3. Kontrol ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dosis 350

mg/kgBB ……….... 49

4. Kelompok perlakuan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. pada tikus jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida dosis 2 mL/kgBB ..………..………..……… 50 D. Gambaran Histologis Ginjal Tikus ………... 54

1. Gambaran histologis kelompok kontrol nefrotoksin karbon

tetraklorida (CCl4) 2 mL/kgBB ……… 54

2. Gambaran histologis kelompok kontrol olive oil 2 mL/kgBB …. 55 3. Gambaran histologis kelompok kontrol ekstrak metanol-air biji

xiii

Persea americana Mill. dosis 350 mg/kgBB ………….………. 57

4. Gambaran histologis kelompok perlakuan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dosis 350 mg/kgBB pada perlakuan 1 jam sebelum induksi CCl4……….……….. 58

5. Gambaran histologis kelompok perlakuan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dosis 350 mg/kgBB pada perlakuan 4 jam sebelum induksi CCl4……… 59

6. Gambaran histologis kelompok perlakuan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dosis 350 mg/kgBB pada perlakuan 6 jam sebelum induksi CCl4……….. 60

E. Rangkuman Pembahasan ……….. 62

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ………... 64

A. Kesimpulan ………... 64

B. Saran ………... 64

DAFTAR PUSTAKA ………...…………. 65

LAMPIRAN ………... 68

DAFTAR TABEL Tabel I. Tabel II. Tabel III. Tabel IV. Tabel V. Tabel VI. Tabel VII. Tabel VIII. Tabel IX. Tabel X.

Total senyawa fenolik dalam kulit, daging buah, biji alpukat dalam ekstrak etil asetat, aseton, metanol……….……….…...……….… Kandungan fitokimia dari Persea americana pada daun, buah dan

biji………

Klasifikasi Acute Kidney Injury (AKI) berdasarkan AKIN pada

tahun 2005 dengan kriteria Cr serum dan UO………...………. Rata-rata kadar kreatinin serum tikus setelah pemberian karbon

tetraklorida dosis 2 ml/kgBB pada selang waktu 0, 24, 48 dan

72 jam (n = 4)……….……….………...……….…… Hasil uji Scheffe kadar kreatinin serum tikus sebelum dan setelah pemberian karbon tetraklorida dosis 2 ml/kgBB pada selang

waktu 0, 24, 48 dan 72 jam……….……….……..……….. Rata-rata kadar kreatinin serum tikus putih jantan Wistar pada

kelompok perlakuan jam ke-1, 4, 6, kontrol EMBPA, kontrol

olive oil dan nefrotoksin 2 mL/kgBB (n = 5)……….…….… Hasil uji Scheffe kadar kreatinin serum tikus putih jantan Wistar pada ke perlakuan jam ke-1, 4, 6, kontrol EMBPA, kontrol olive

oil dan nefrotoksin 2 mL/kgBB……….………...…..…… Perbandingan kontrol olive oil jam ke-0 dan jam ke-48 pada

kreatinin serum tikus putih jantan Wistar ( n = 5 )……….……… Hasil penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill…………. Hasil rendemen ekstrak metanol-air Biji Persea americana Mill………

8 9 21 40 41 44 45 47 95 95

xv

Tabel XI. Tabel XII.

Bobot pengeringan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill…..

Hasil validitas dan reabilitas dilihat dari serum kontrol (range 1,09 - 1,71 mg/dL)……….….………..

96

DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Gambar 2. Gambar 3. Gambar 4. Gambar 5. Gambar 6. Gambar 7. Gambar 8. Gambar 9. Gambar 10. Gambar 11.

Gambar skema unsur-unsur struktural ginjal pada irisan ginjal yang terpotong dua……… Foto mikroskopik glomerulus, kapsula Bowman, tubulus proksimal dan distal……… Foto mikroskopik tubulus kontortus proksimal (p), tubulus

kontortus distal………

Duktus koligens secara mikroskopik………... Foto mikroskopik ginjal………... Tahapan biosintesis dan metabolisme kreatinin………….. Diagram batang rata-rata kadar kreatinin serum tikus sebelum dan setelah pemejanan karbon tetraklorida dosis 2 ml/kgBB pada selang waktu 0, 24, 48 dan 48 jam.…….. Diagram batang aktivitas kreatinin serum tikus putih jantan Wistar pada kelompok perlakuan jam ke-1, 4, 6, kontrol EMBPA, kontrol olive oil dan nefrotoksin 2

mL/kgBB……….………

Perbandingan kontrol olive oil jam ke-0 dan jam ke-48 pada kreatinin serum tikus putih jantan Wistar……… Foto mikroskopik organ gijal tikus kelompok kontrol CCl4

2 mL/kgBB perbesaran 400x………... Foto mikroskopik organ gijal tikus kelompok kontrol negatif olive oil 2 mL/kgBB perbesaran 400x yang

11 12 14 16 16 19 40 46 48 55

xvii

Gambar 12.

Gambar 13.

Gambar 14.

Gambar 15.

Gambar 16.

menunjukkan adanya DHET……… Foto mikroskopik organ gijal tikus kelompok kontrol negatif olive oil 2 mL/kgBB perbesaran 400x yang menunjukkan adanya ITC……….... Foto mikroskopik organ gijal tikus kelompok perlakuan 1 jam sebelum induksi CCl4 perbesaran 400x yang

menunjukkan adanya perivaskulitis………...….. Foto mikroskopik organ gijal tikus kelompok perlakuan 4 jam sebelum induksi CCl4 perbesaran 400x………

Foto mikroskopik organ gijal tikus kelompok perlakuan 4 jam sebelum induksi CCl4 perbesaran 400x yang

menunjukkan adanya DHET……… Foto mikroskopik organ gijal tikus kelompok perlakuan 4 jam sebelum induksi CCl4 perbesaran 400x yang

menunjukkan adanya DHET………

56

56

59

60

61

DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Lampiran 2. Lampiran 3. Lampiran 4. Lampiran 5. Lampiran 6. Lampiran 7. Lampiran 8. Lampiran 9. Lampiran 10.

Foto serbuk biji Persea americana Mill.………... Foto ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill….... Foto suspensi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dalam CMC-Na 1%... Surat pengesahan determinasi serbuk biji Persea americana Mill………... Surat pengesahan Medical and Health Research Ethics Committee (MHREC)………. Analisis statistik kadar kreatinin serum pada uji pendahuluan nefrotoksin karbon tetraklorida dosis 2

mL/kgBB………

Analisis statistik kadar kreatinin serum pada kelompok perlakuan ekstrak metanol-air biji Persea americana dosis 350 mg/kgBB pada tikus jantan Wistar terinduksi karbon tetraklorida 2 mL/kgBB……… Analisis statistik kadar kreatinin serum pada kontrol negatif olive oil dosis 2 ml/kgBB………...…… Data hasil pengecekan histologis ginjal pada kelompok perlakuan dan kelompok kontrol ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dosis 350 mg/kgBB………. Data hasil pengecekan histologis ginjal pada kelompok kontrol negatif olive oil 2 mL/kgBB dan kelompok

69 69 69 70 71 72 79 84 87

xix Lampiran 11. Lampiran 12. Lampiran 13. Lampiran 14. Lampiran 15. Lampiran 16. Lampiran 17. Lampiran 18. Lampiran 19. Lampiran 20. Lampiran 21. Lampiran 22.

kontrol nefrotoksin karbon tetraklorida 2 mL/kgBB…….. Foto mikroskopik ginjal kelompok kontrol nefrotoksin karbon tetraklorida 2 mL/kgBB………. Foto mikroskopik ginjal kelompok kontrol negatif olive

oil 2 mL/kgBB………

Foto mikroskopik kelompok perlakuan ekstrak pemberian 1 jam sebelum pemejanan karbon tetraklorida

2 ml/kgBB………..

Foto mikroskopik kelompok perlakuan ekstrak pemberian 4 jam sebelum pemejanan karbon tetraklorida

2 ml/kgBB………..

Foto mikroskopik kelompok perlakuan ekstrak pemberian 6 jam sebelum pemejanan karbon tetraklorida

2 ml/kgBB………..

Perhitungan % nefroprotektif………. Perhitungan konversi dosis untuk manusia……… Perhitungan konversi hari untuk manusia……….. Penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill… Hasil rendemen ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill………... Bobot pengeringan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill………... Hasil pengukuran validitas dan reabilitas………

89 91 91 92 92 93 93 94 94 94 95 96 97

INTISARI

Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan informasi tentang efek nefroprotektif ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. pada dosis 350 mg/kgBB secara jangka pendek pada waktu pemberian 1, 4 dan 6 jam sebelum pemejanan karbon tetraklorida (CCl4) dosis 2 mL/kgBB konsentrasi 50% v/v dan

juga mengetahui waktu efektif pemberian ekstrak untuk digunakan sebagai nefroprotektor.

Penelitian bersifat eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah. Hewan uji yang digunakan adalah tikus putih jantan galur Wistar umur 2-3 bulan dengan berat 150-250 gram. Terdapat 6 kelompok pada penelitian, yaitu kelompok I yang merupakan kelompok kontrol nefrotoksin CCl4 2

mL/kgBB, kelompok II adalah kelompok kontrol negatif olive oil 2 mL/kgBB. Olive oil pada penelitian digunakan sebagai pelarut CCl4. Kelompok III merupakan

kelompok kontrol ekstrak dosis 350 mg/kgBB. Kelompok IV, V, dan VI secara berturut-turut adalah kelompok perlakuan 1, 4, 6 jam pemberian ekstrak dosis 350 mg/kgBB sebelum pemejanan CCl4. Jumlah tikus yang digunakan untuk setiap

kelompok adalah 5 ekor. Pengecekan dilakukan dengan mengukur kadar kreatinin serum pada waktu pencuplikan darah optimal yaitu pada 48 jam setelah pemejanan atau induksi CCl4. Metode analisis statistic dilakukan dengan menggunakan uji

Kolmogorov-Smirnov, Levene test, uji t-berpasangan, One way ANOVA dan uji Scheffe.

Berdasarkan data yang diperoleh, ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dosis 350 mg/kgBB terbukti memiliki khasiat nefroprotektif pada tikus jantan Wistar terinduksi CCl4 2 mL/kgBB secara jangka pendek. Waktu

efektif pemberian ekstrak untuk memberikan efek nefroprotektif berdasarkan data penurunan kadar kreatinin serum diketahui pada 1 jam sebelum pemejanan CCl4

dengan % efek nefroprotektif sebesar 90,5%.

Kata kunci : Biji Persea americana Mill., ekstrak metanol-air, nefroprotektif, jangka pendek, karbon tetraklorida

xxi

ABSTRACT

This study aimed to obtain information about the effects of methanol-water seed extract of Persea americana Mill. seed as nephroprotective agent at dose 350 mg/kgBW in short term 1, 4 and 6 hours administration of extract before exposured to carbon tetrachloride (CCl4) 50% v/v at dose of 2 mL/kgBW and also

determined the effective time of extract as nephroprotective agent.

This study was experimentally pure with direct sampling design. This study used male Wistar rats aged 2-3 months and weight 150-250 g. There are 6 groups in this study, group I was nephrotoxins CCl4 2 mL/kgBW control group,

group II was the negative control group (olive oil) 2 mL/kgBW. Olive oil was used as solvent of CCl4. Group III was extract control group at dose 350 mg/kgBW.

While groups IV, V, and VI respectively were treated group 1, 4, 6 hours administration of extract at dose 350 mg/kgBB before exposure to CCl4. Each

group used 5 rats. The test was done by measuring serum creatinine concentration at the optimum time of blood sampling (48 hours after CCl4 exposure). Statistical

analysis was performed using the Kolmogorov-Smirnov test, Levene's test, Paired t-Test, One-way ANOVA and Scheffe test.

Based on the data that obtained, the methanol-water extract of Persea americana Mill. seed at dose of 350 mg/kgBW gave nephroprotective effect in male Wistar rats induced by CCl4 2 mL/kgBW in the short term. Effective time of

administration of extract as nephroprotective agent based on the data of serum creatinine concentration was 1 hour before CCl4 exposure with 90.5%

nephroprotective effect.

Keywords: Persea americana Mill. seed, Methanol-water extracts, nephroprotective, short-term, carbon tetrachloride

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang

Ginjal adalah organ yang berperan penting dalam fungsi metabolisme dan terutama fungsi ekskresi dalam tubuh. Setiap hari ginjal memproses sekitar 200 liter darah untuk disaring dan menghasilkan sekitar 2,0 liter ekstra kelebihan air yang mengandung limbah (Hadibroto dan Alam, 2007). Berdasarkan fungsinya yang sangat penting, kesehatan dari ginjal haruslah terjaga dengan baik.

Kebanyakan bahan alam yang digunakan berasal dari tanaman. Persea americana Mill. atau dikenal dengan sebutan alpukat merupakan salah satu tanaman yang dapat tumbuh dengan baik pada daerah tropis seperti Indonesia dan memiliki banyak khasiat. Namun, sejauh ini pemanfaatan yang banyak dilakukan terbatas pada buah dan daunnya saja, sedangkan biji Persea americana Mill. belum banyak dimanfaatkan. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Zuhrotun (2007), menunjukkan bahwa biji alpukat mengandung polifenol, flavonoid, triterpenoid, kuinon, saponin, tanin dan monoterpenoid serta seskuiterpenoid.

Kandungan yang dimiliki biji alpukat atau Persea americana Mill. juga telah dinyatakan pada penelitian yang dilakukan oleh Carpena, Morcuende, Andrade, Kylli, Estevez (2011) memiliki khasiat sebagai antioksidan. Antioksidan sendiri dapat bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa yang bersifat oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan akan terhambat (Winarsi, 2007). Dengan kemampuan biji alpukat sebagai antioksidan tersebut

dimungkinkan biji alpukat juga memiliki khasiat sebagai pelindung organ ginjal dari senyawa toksik atau dikenal dengan nefroprotektif. Untuk mengetahui adanya kerusakan ginjal dapat diamati dengan mengukur kadar kreatinin di dalam darah. Pada kegagalan ginjal, kreatinin akan ditahan bersama unsur nitrogen non protein lainnya (Panjaitan, Handharyani, Chairul, Masriani, Zakiah, Manalu, 2007).

Senyawa xenobiotik yang dapat digunakan sebagai model untuk meneliti aktivitas nefroprotektif adalah karbon tetraklorida (CCl4). CCl4 akan menginduksi

peroksidasi lipid dan keracunan, CCl4 dimetabolisme menjadi radikal bebas

triklorometil yang pada akhirnya radikal bebas ini dapat menyebabkan kematian sel (Panjaitan dkk, 2007). Oleh karena itu penelitian ini menggunakan CCl4

sebagai nefrotoksin (senyawa toksik untuk ginjal).

Penelitian dilakukan menggunakan hewan uji tikus putih jantan galur Wistar yang memiliki kemiripan fisiologis dengan manusia dengan senyawa nefroprotektif adalah ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. (biji buah alpukat) dosis 350 mg/kgBB secara jangka pendek. Jangka pendek yang dimaksudkan dalam penelitian ini adalah pada waktu 1, 4 dan 6 jam pemberian ekstrak metanol-air biji Persea ameicana Mill. 350 mg/kgBB dengan konsentrasi sebesar 7% b/v sebelum pemejanan karbon tetraklorida 2 mL/kgBB, dengan konsentrasi karbon tetraklorida sebesar 50% v/v. Pemilihan ekstrak metanol-air berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan Vionita (2013) dan penelitian terkait efek antioksidan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. (Carpena et al., 2011). Dari hasil penelitian tersebut biji alpukat (Persea americana Mill.) diketahui memiliki kandungan senyawa fenolik yang berkhasiat sebagai

antioksidan dan dapat terambil dengan baik dengan menggunakan pelarut metanol-air (70 : 30). Selain itu karena belum diketahuinya metabolit sekunder apakah yang ada dalam biji Persea americana Mill. yang memiliki khasiat sebagai nefroprotektif secara pasti maka dipilih pelarut metanol yang dapat mengekstraksi hampir keseluruhan metabolit sekunder yang ada dalam biji Persea americana Mill. (ekstraksi total).

Penelitian dilakukan secara jangka pendek dengan menggunakan dosis 350 mg/kgBB ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dengan tujuan untuk mengetahui pengaruh waktu pemberian ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. sehingga dapat diketahui waktu efektif pemberian ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dosis 350 mg/kgBB untuk digunakan sebagai nefroprotektor. Dosis 350 mg/kgBB dipilih berdasarkan penelitian Vionita (2013) yang menunjukkan dengan dosis 350 mg/kgBB, ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. telah mampu memberikan efek nefroprotektif secara jangka panjang (6 hari pemberian ekstrak metanol-air secara berturut-turut sebelum induksi karbon tetraklorida 2 mL/kgBB) dengan cukup baik.

1. Perumusan masalah

Berdasarkan latar belakang diatas dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut :

a. Apakah ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dosis 350 mg/kgBB memiliki khasiat nefroprotektif terhadap tikus putih jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida 2 mL/kgBBsecara jangka pendek?

b. Berapa waktu efektif pemberian ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dosis 350 mg/kgBB sebagai nefroprotektif dilihat dari kadar kreatinin dan gambaran histologis sel ginjal tikus jantan Wistar terinduksi karbon tetraklorida 2 mL/kgBB?

2. Keaslian penelitian

Penelitian tentang efek nefroprotektif ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dosis 350 mg/kgBB pada tikus jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida 2 ml/kgBB secara jangka pendek belum pernah dilakukan sebelumnya. Penelitian yang telah dilakukan berkaitan dengan biji Persea americana Mill. yaitu :

1. Penelitian yang dilakukan oleh Arukwe et al. (2012). Penelitian tersebut dilakukan untuk mengetahui kandungan dari biji, daun, dan buah Persea americana.

2. Penelitian yang dilakukan oleh Carpena et al. (2011). Penelitian ini melakukan uji secara in vitro mengenai aktivitas antioksidan, anti mikroba biji Persea americana Mill.

3. Penelitian yang dilakukan oleh Zuhrotun (2007). Penelitian tersebut menguji aktivitas antidiabetes dari ekstrak etanol biji Persea americana Mill.

4. Penelitian yang dilakukan oleh Vionita (2013). Penelitian ini melakukan uji efek nefroprotektif ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. secara jangka panjang dengan menggunakan 3 peringkat dosis.

Pada penelitian yang akan dilakukan, penelitian dilakukan untuk menguji efek ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. sebagai nefroprotektor

secara jangka pendek dengan menggunakan dosis 350 mg/kgBB pada tikus putih jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida dengan melihat kadar kreatinin serum dan gambaran histologis ginjal sebagai data pendukung.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis. Penelitian bermanfaat untuk menambah pengetahuan tentang tanaman yang memiliki khasiat nefroprotektif.

b. Manfaat praktis. Penelitian dapat memberikan informasi terkait waktu efektif penggunaan ekstrak biji alpukat (Persea americana Mill.) secara jangka pendek sebagai dasar pengobatan nefroprotektif.

B.Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum

Penelitian dilakukan untuk menggali informasi mengenai khasiat ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. sebagai nefroprotektor secara jangka pendek untuk pembangan ilmu kefarmasian.

2. Tujuan khusus

Penelitian dilakukan untuk memperoleh data dan informasi tentang efek nefroprotektif ekstrak metanol-air biji Persea americana Miil. dosis 350 mg/kgBB terhadap tikus jantan Wistar terinduksi karbon tetraklorida 2 mL/kgBB secara jangka pendek dan mengetahui waktu efektif pemberian ekstrak untuk digunakan sebagai nefroprotektor pada dosis 350 mg/kgBB.

6 BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A.Taksonomi dan Morfologi Alpukat (Persea americana Mill.) Taksonomi dari alpukat sebagai berikut.

Kingdom : Plantae

Divisi : Magnoliophyta Subdivisi : Spermatophyta Kelas : Magnoliopsida Ordo : Laurales Famili : Lauraceae Genus : Persea

Spesies : Persea americana Mill (USDA, 2013).

Persea terdiri dari 200 jenis tumbuhan yang berasal dari bagian tropis Amerika Tengah dan Amerika Selatan. Di Indonesia Persea tumbuh di lahan terbuka pada ketinggian 200-1.000 m diatas permukaan laut. Tanaman ini disebut avokad namun di Indonesia dikenal dengan alpukat. Alpukat berasal dari Amerika tropis, Meksiko, Guatemala, dan Hindia Barat (Suhono dkk, 2010).

Morfologi alpukat berupa pohon besar dengan kulit batang berwarna coklat, tinggi batang 8-20 m, dan diameternya 25-40 cm. Daun tunggal berwarna hijau tua, berbentuk lonjong atau memanjang. Daun bertangkai dan mengumpul pada bagian ujung ranting, berukuran 8 x 17 cm. Bunga berwarna putih kekuningan dan wangi. Bunga berkelamin ganda. Benang sari berjumlah 12, berwarna coklat atau jingga dan tumbuh mengelilingi putik (Suhono dkk, 2010).

Buah alpukat berbentuk bulat atau lonjong seperti bola lampu. Buahnya berwarna hijau, hijau kekuningan, dan cokelat keunguan. Buah alpukat berukuran 5-30 cm, dengan berat 100-600 g. Daging buahnya berwarna hijau kekuningan atau kuning. Buah berdaging tebal, berminyakm terasa hambar atau sedikit manis. Alpukat memiliki biji tunggal, berukuran besar, berbentuk bulat atau lonjong, dan ditutupi oleh selaput biji (Suhono dkk, 2010).

Daging buah alpukat dapat dimakan segar. Secara tradisional, rebusan daun alpukat digunakan untuk mengobati hipertensi, sakit kepala, kencing manis, sariawan, nyeri lambung, nyeri saraf, dan meredakan rasa sakit (Suhono dkk, 2010).

B. Kandungan Fitokimia Biji Persea americana Mill.

Biji alpukat (Persea americana Mill.) mengandung berbagai macam senyawa metabolit sekunder. Salah satunya adalah senyawa golongan fenolik. Senyawa fenolik dapat berfungsi sebagai antioksidan karena dapat mengalami reaksi redoks, yang menyebabkan senyawa tersebut dapat berfungsi sebagai agen pereduksi, donor hidrogen, penetral radikal bebas dan pengkhelat logam. Kulit dan biji Persea americana Mill. memiliki efek antioksidan yang cukup besar. Efek ini bergantung pada varietasnya. Ekstrak dari Persea americana tidak memiliki komponen yang toksik atau berbahaya. Metanol dapat digunakan untuk mengekstrak senyawa fenolik total untuk uji aktivitas antioksidan secara in vitro dengan cukup baik (Carpena et al., 2011). Berikut adalah tabel kandungan senyawa fenolik total pada biji alpukat.

Tabel I. Total senyawa fenolik dalam kulit, daging buah, biji alpukat dalam ekstrak etil asetat, aseton, metanol

(Carpena et al., 2011). Tabel tersebut menunjukkan bahwa dalam ekstrak metanol dari Persea americana varietas Hass mengandung 3511b ± 988 (mg GAE/100 mg bahan kering) senyawa fenolik total sedangkan pada varietas Fuerte mengandung 4164b ± 1048 (mg GAE/100 mg bahan kering) senyawa fenolik total (Carpena et al., 2011). Meskipun varietas Fuerte dan Hass jarang dibudidayakan di Indonesia, namun dari penelitian tersebut dapat diketahui bahwa metanol dapat mengekstrak senyawa fenolik dalan biji Persea americana Mill. dengan cukup baik.

Persea americana Mill. mengandung berbagai macam senyawa fitokimia, diantaranya adalah saponin, tanin, flavonoid, sianogenik glikosida, alkaloid, fenol, steroid (Arukwe et al., 2012). Tabel II adalah tabel yang menunjukkan kandungan fitokimia pada daun, buah, dan biji Persea americana Mill. dan dengan mengetahui kandungan fitokimianya dapat diprediksi khasiat dari bagian daun, buah dan biji Persea americana Mill. tersebut. Diketahui pada bagian biji mengandung senyawa fenolik lebih besar dari bagian daun dan buah sehingga

dimungkinkan biji Persea americana Mill. memiliki khasiat sebagai antioksidan yang baik (Arukwe et al., 2012).

Tabel II. Kandungan fitokimia dari Persea americana pada daun, buah dan biji

(Arukwe et al., 2012). C. Ginjal

Ginjal merupakan organ yang berbentuk seperti kacang dan umumnya ginjal manusia memiliki panjang 10-12 cm, lebar 5-6 cm, dan dan tebal 3-4 cm. ginjal tersebut terletak pada bagian retro-peritoneal dekat dinding posterior abdomen di bagian kiri dan kanan kolom vertebralis (Bloom dan Fawcett, 1994). Komponen sistem urinaria terdiri dari dua ginjal yang memproduksi urin, dua ureter yang membawa urin ke dalam sebuah kandung kemih untuk penampungan sementara dan uretra yang mengalirkan urin keluar tubuh (Sloane, 1995).

1. Fungsi ginjal

Ginjal memiliki banyak fungsi penting bagi tubuh, fungsi tersebut antara lain, yaitu :

a. Pengeluaran zat sisa organik. Ginjal mengekskresi urea, asam urat, kreatinin, dan produk penguraian hemoglobin dan hormon.

b. Pengaturan konsentrasi ion-ion penting. Ginjal mengekskresi ion natrium, kalium, kalsium, magnesium, sulfat dan fosfat. Ekskresi ion-ion ini seimbang

dengan asupan dan ekskresinya melalui rute lain seperti pada saluran gastrointestinal atau kulit.

c. Pengaturan keseimbangan asam basa tubuh. Ginjal mengendalikan ekskresi ion hidrogen (H+), bikarbonat (HCO3-) dan ammonium (NH4+) serta

memproduksi urin asam atau basa, bergantung pada kebutuhan tubuh.

d. Pengaturan produksi sel darah merah. Ginjal melepas eritropoietin yang mengatur produksi sel darah merah dalam sumsum tulang.

e. Pengaturan tekanan darah. Ginjal mengatur volume cairan yang essensial bagi pengaturan tekanan darah, dan juga memproduksi enzim renin yang merupakan komponen penting dalam sistem renin-angiotensin-aldosteron, yang berperan dalam peningkatan tekanan darah dan retensi air.

f. Pengendalian terbatas terhardap konsentrasi glukosa darah dan asam amino darah. Ginjal melalui ekskresi glukosa dan asam amino berlebih, bertanggung jawab atas konsentrasi nutrien dalam darah.

g. Pengeluaran zat beracun. Ginjal mengeluarkan polutan, zat tambahan makanan, obat-obatan atau zat kimia asing lain dari tubuh (Sloane, 1995).

Ginjal memproduksi urin yang mengandung zat sisa metabolik dan mengatur komposisi cairan tubuh melalui 3 cara, yaitu filtrasi glomerulus, reabsorpsi tubulus dan sekresi tubulus. Fungsi utama ginjal adalah untuk mengekskresikan zat dari sisa metabolisme serta zat-zat lain yang berbahaya bagi tubuh sambil mempertahankan konstituen darah yang masih berguna. Selain itu, ginjal juga memiliki fungsi endokrin yang penting (Davey, 2002).

2. Anatomi dan fisiologi ginjal

Setiap ginjal (Gambar 1) dilingkupi kapsul tipis dari jaringan fibrus yang rapat dan membentuk pembungkus yang halus.di dalamnya terdapat struktur-struktur ginjal yang berwarna ungu tua dan terdiri dari kortex pada bagian luar dan medula, disebelah dalam. Bagian medula tersusun atas 15-16 massa berbentuk piramid yang disebut piramid ginjal. Puncak langsung mengarah ke hilum dan berakhir di kalises. Kalises ini menghubungkannya dengan pelvis ginjal (Pearce, 2002).

Gambar 1. Gambar skema unsur-unsur struktural ginjal pada irisan ginjal yang terpotong dua. (Bllom dan Fawcett, 1994).

Dalam ginjal manusia terdapat sekitar 1 sampai 4 juta nefron. Nefron ini merupakan unit pembentuk urin. Dalam setiap nefronnya terdapat komponen tubular dan vaskular (kapilar). Komponen tersebut, yaitu tubulus kontortus proksimal, ansa Henle, tubulus kontortus distal dan duktus koligen. Pada setiap ujung proksimal setiap nefron terdapat kapsula Bowman yang merupakan struktur berongga menyerupai bentuk mangkok. Di dalam bagian ini terdapat berkas-berkas globular kapiler yang sangat berkelok, disebut glomerulus. Kapsul

Bowman dan glomerulus bersama-sama membentuk korpuskel ginjal (Bloom dan Fawcett, 1994). Berikut penjelasan lebih lanjut mengenai komponen ginjal :

a. Glomerulus. Glomerulus adalah gulungan kapiler yang dikelilingi oleh kapsul epitel berdinding ganda yang disebut dengan kapsula Bowman. (Sloane, 1995). Sedangkan kapsula Bowman merupakan suatu pelebaran nefron yang dibatasi oleh epitel yang menyelubungi glomerulus (Gambar 2) untuk mengumpulkan zat terlarut yang difiltrasi oleh glomerulus (Sherwood, 2006).

Filtrasi Ginjal terjadi apabila darah sistemik mengalir melalui glomerulus. Laju filtrasi bergantung pada aliran darah arteri, tekanan darah arteri sistemik, dan tekanan aliran internal dalam ginjal. Air dan mineral terlarut dengan ukuran molekul kecil, terutama elektrolit bebas melewati saringan glomerulus. Sekitar 125 mL filtrat dihasilkan setiap menit, atau sekitar 140 L air per hari (Sacher dan Richard, 2002).

Gambar 2. Foto mikroskopik glomerulus, kapsula Bowman, tubulus proksimal dan distal (SIU School of Medicine, 2005).

Gambar diatas adalah gambar mikroskopik dari glomerulus yang terdapat pada ginjal. Dari gambar terlihat bahwa glomerulus diselubungi oleh kapsula

Bowman (Bowman’s space). Pada bagian glomerulus tersebut terdapat sel-sel epitel viseralis termodifikasi atau disebut podosit (filtration membrane) yang terdapat pada bagian luar glomerulus dan menutupi kapiler. Podosit tersebut berfungsi untuk membantu filtrasi cairan darah menjadi urin primer atau ultra filtrat (Pardede, 2004). Terlihat pula pada bagian kapsula Bowman tersebut terdapat sel-sel epitel sebagai pembatasnya (epithelium of Bowman’s capsule). Dibagian kapsula Bowman terhubung langsung dengan tubulus kontortus proksimal (proximal tubule). Bagian yang berwarna hitam keunguan adalah inti sel. Sel-sel yang menyusun kapsula Bowman adalah sel-sel epitel gepeng. Pada gambar tersebut terlihat bahwa sel-sel epitel gepeng kapsula Bowman menyatu dengan sel-sel kuboid tubulus kontortus proksimal (Bloom dan Fawcett, 1994).

b. Tubulus kontortus proksimal. Hasil dari filtrasi glomerulus akan mengalir menuju tubulus kontortus proksimal. Tubulus ini bentuknya berkelok-kelok dengan diameter 50-60 nm (Davey, 2002). Tubulus proksimalis terutama berfungsi dalam proses reabsorpsi. Bagian ini mengembalikan sejumlah besar air bersama dengan glukosa, asam amino, urea, kalsium, dan protein apapun yang bocor melaui saringan glomerulus ke aliran darah. Tubulus proksimalis juga mereabsorpsi sejumlah besar elektrolit terutama natrium, klorida, dan bikarbonat (Davey, 2002). Panjang tubulus ini mencapai 15 mm dan sangat berliku. Pada permukaan yang menghadap lumen tubulus ini terdapat sel-sel epitel kuboid yang kaya akan mikrovilus (brush border) dan memperluas area permukaan lumen (Sloane, 1995).

c. Ansa Henle. Tubulus kontortus proksimal mengarah ke tungkai desenden ansa Henle yang masuk ke dalam medula, membentuk lengkungan jepit yang tajam (lekukan), dan membalik ke atas membentuk tangkai asenden ansa Henle (Sloane, 1995).

d. Tubulus kontortus distal. Tubulus kontortus distal sangat berliku dan membentuk segmen terakhir nefron (Sloane, 1995). Tubulus proksimal dan distal adalah tempat sekresi yang paling umum. Sekresi merupakan suatu proses yang sangat selektif yang melibatkan transport pasif maupun transport aktif. Sebagai contoh, sekresi terkontrol ion hidrogen dari cairan interstisial ke dalam tubula nefron penting dalam mempertahankan pH yang konstan bagi cairan tubuh (Sloane, 1995). Pada bagian ini juga terdapat kompleks jukstaglomerular yang berfungsi dalam proses pengaturan tekanan darah dan kecepatan filtrasi glomerulus (Bloom dan Fawcett, 1994).

Gambar 3. Foto mikroskopik tubulus kontortus proksimal (p), tubulus kontortus distal (d) (SIU School of Medicine, 2005).

Gambar diatas (Gambar 3) adalah gambar mikroskopik dari ginjal yang menunjukkan tubulus kontortus proksimal, bagian dengan simbol huruf “p” dan

keunguan adalah inti sel dari sel epitel. Pada bagian tubulus kontortus distal dan proksimal tersebut terdapat bagian berwarna keputihan yang merupakan ruang yang terdapat di tubulus kontortus distal dan proksimal. Ruang tersebut merupakan ruang (lumen tubulus) yang pada sistem urinaria berisi cairan hasil filtrasi dari glomerus yang mengalami proses lebih lanjut untuk nantinya menjadi urin.

Tubulus proksimal merupakan segmen terpanjang dari nefron dan merupakan bagian terbesar dari korteks ginjal (Bloom dan Fawcett, 1994). Sel-sel epitel tubulus proksimal adalah sel-sel epitel kuboid (simple cuboidal) yang memiliki brush border yang mencolok. Lumen segmen ini sering tampak tertutup oleh brush border sel epitelnya pada pengamatan secara histologis (Bloom dan Fawcett, 1994). Tubulus kontortus distal pada pengamatan secara mikroskopik Nampak terdapat pada kutub vaskuler dari glomerulus (Gambar 1) diantara artetiol aferen dan eferen (Bloom dan Fawcett, 1994). Sel-sel epitel tubulus kontortus distal juga merupakan sel-sel epitel kuboid (simple cuboidal) (SIU

School of Medicine, 2005). Lumen tubulus kontortus distal terlihat lebih “bersih”

atau jelas apabila dibandingkan dengan lumen tubulus kontortus proksimal (Gambar 3).

e. Tubulus koligen/duktus pengumpul. Duktus pengumpul membawa filtrat kembali menuju medula dan pelvis renal. Duktus koligen akan menerima cairan dan zat terlarut dari tubulus distal. Setiap duktus pengumpul yang berjalan kearah medula akan mengosongkan urin yang telah terbentuk ke dalam pelvis ginjal (Sherwood, 2006).

Gambar 4 menunjukkan gambar dari duktus koligen (disimbolkan dengan

“cd” ) secara mikroskopik. Duktus koligen ini tersusun atas sel-sel epitel kuboid (simple cuboidal). Bagian yang berwarna keunguan menunjukkan inti selnya,

sitoplasmanya terlihat “bersih” (clear) dengan batas sel yang terlihat jelas (SIU School of Medicine, 2005).

Gambar 4. Duktus koligens secara mikroskopik (SIU School of Medicine, 2005). Gambar 5 memberikan gambar mikroskopik dari ginjal secara keseluruhan. Dari gambar terlihat tiga bagian penyusun ginjal, yaitu glomerulus

(“glom”) pada gambar yang diselubungi oleh suatu ruangan yang merupakan

kapsula Bowman (Bowman space), tubulus kontortus distal terlihat seperti ruang panjang (distal tubules) dan tubulus kontortus proksimal (proximal tubules)

D. Gangguan Sistem Urinaria

Sistem urinaria terdiri dari ginjal, ureter, kandung kemih dan uretra. Pada sistem urinaria dapat terjadi beberapa macam gangguan karena berbagai macam faktor. Berikut adalah beberapa gangguan yang mungkin terjadi pada sistem urinaria.

1. Pielonefritis dan infeksi saluran kemih

Pielonefritis Merupakan inflamasi ginjal pada pelvis ginjal, hal ini disebabkan karena adanya infeksi bakteri (Sloane, 1995). Infeksi saluran kemih (ISK atau UTI/urinary tract infection) menunjukkan infeksi pada kandung kemih (sistitis), uretra atau ureter, ginjal (pielonefritis) atau semua organ di atas (Fausto, Abbas, Kumar, Mitchell, 2006).

2. Gagal ginjal

Gagal ginjal akan menyebabkan ginjal kehilangan fungsinya. Gagal ginjal tesebut dapat mengakibatkan terjadinya retensi garam, air, zat buangan seperti nitrogen (urea dan kreatinin) dan penurunan drastis volume urin (oliguria). Gagal ginjal yang tidak diobati dapat mengakibatkan kehilangan total fungsi ginjal dan bahkan kematian. Gagal ginjal sendiri dibagi lagi menjadi 2 macam yaitu gagal ginjal akut dan gagal ginjal kronik (Sloane, 1995).

a. Gagal ginjal akut. Pada gagal ginjal akut. Ginjal tidak lagi mampu megekskresi limbah hasil metabolism tubuh hal ini biasanya karena hipoperfusi ginjal. Sindrom ini dapat menyebabkan azotemia (uremia), yaitu akumulasi produk limbah nitrogen dalam darah dan oliguria, keluaran urin kurang dari 400

ml/24 jam, dimungkinkan 9% dari gagal ginjal akut disebabkan oleh nefrotoksin (Tambayong, 1999).

Gagal ginjal akut adalah suatu sindrom yang ditandai oleh penurunan yang cepat pada laju filtrasi glomerulus (GFR) dalam waktu beberapa hari sampai beberapa minggu disertai akumulasi zat sisa metabolisme nitrogen. Sindrom ini sering ditemukan lewat peningkatan kadar kreatinin, ureum serum, disertai dengan penurunan output urin. (Davey, 2002).

b. Gagal ginjal kronik. Berbeda dengan gagal ginjal akut, gagal ginjal kronik bersifat progresif dan ireversibel. Progresi gagal ginjal kronik melewati 4 tahap, yaitu penurunan cadangan ginjal, insufisiensi ginjal, gagal ginjal dan end-stage renal disease (Baradero, Dayit, Siswadi, 2005).

3. Nekrosis tubular akut

Dua penyebab nekrosis tubular akut yang paling umum adalah isekmia dan nefrotoksin. Agen nefrotoksin secara langsung merusak sel-sel tubuli, koagulasi intravaskular, pengendapan kristal oksalat dan asam urat serta hipoksia jaringan (Tambayong, 1999). Nekrosis Tubular Akut (ATN; Acute Tubular Necrosis) merupakan penyebab gagal ginjal akut yang paling sering ditemukan; penyakit ini ditandai oleh destruksi sel epitel tubulus ginjal karena iskemia atau nefrotoksin (Fausto, Abbas, Kumar, Mitchell, 2006).

a. ATN iskemik. ATN iskemik merupakan lesi reversible yang timbul pada sejumlah keadaan klinis (misalnya, syok, sirkulasi yang kolaps, dehidrasi); semua keadaan tersebut ditandai oleh periode aliran darah yang cukup ke dalam ginjal sehingga terjadi hipoksia (Fausto, Abbas, Kumar, Mitchell, 2006).

b. ATN nefrotoksik. ATN ini dapat disebabkan oleh berbagai macam obat (misalnya, gentamisin, sefalosporin, metoksifluran, siklosporin, media kontras) dan toksin (misalnya, air raksa, timbal, arsen, metil alkohol, etilen glikol, dan jenis jamur tertentu, insektisida serta herbisida) (Fausto, Abbas, Kumar, Mitchell, 2006).

E. Kreatinin

Kreatinin difiltrasi oleh glomerulus dan diekskresikan dalam urin. Kadar kreatinin sebesar 2,5 mg/dL dapat menjadi indikasi kerusakan ginjal. Kreatinin serum sangat berguna untuk mengevaluasi fungsi glomerulus (Kee, 2008).

Kreatinin merupakan hasil metabolisme sel otot yang terdapat di dalam darah setelah melakukan kegiatan. Ginjal akan membuang kreatinin dari darah ke urin. Apabila terjadi penurunan fungsi ginjal maka kadar kreatinin di dalam darah akan mengalami peningkatan. Kadar kreatinin normal di dalam plasma manusia adalah 0,6 – 1,2 mg/dL (Hadibroto dan Alam, 2007).

Kreatinin merupakan indikator kuat bagi fungsi ginjal, peningkatan kadar dua kali lipat dari serum normal menunjukkan penurunan fungsi ginjal sebanyak 50 %. (Amiria, 2008. Cit Saraswati 2011). Tahap biosintesis dan metabolisme kreatinin adalah sebagai berikut :

Kreatinin merupakan produk sisa yang diekskresikan oleh ginjal terutama melalui filtrasi glomerulus. Konsentrasi kreatinin dalam plasma pada individu sehat pada umumnya konstan, tidak terpengaruh oleh jumlah air yang diminum, beban kerja dan kecepatan produksi urin. Kenaikan kadar kreatinin dalam plasma selalu mengindikasikan adanya penurunan ekskresi yang disebabkan oleh adanya gangguan fungsi ginjal (Sumaryono, 2008).

Bila glomerulus filtration rate (GFR) turun, maka kreatinin plasma meningkat. Kreatinin plasma merupakan indeks GFR yang lebih cermat karena kecepatan produksinya terutama merupakan fungsi dari masssa otot yang sedikit sekali mengalami perubahan (Price and Wilson, 2006) dengan kata lain, kadar kreatinin tergantung pada masa otot dan tidak dipengaruhi diet, hidrasi, atau katabolisme jaringan, kadar kreatinin merupakan indikator fungsi ginjal yang lebih akurat daripada Blood Urea Nitrogen (BUN). Kadar kreatinin serum akan meningkat sesuai penurunan fungsi ginjal (Horne dan Swearingen, 2001). Menurut Malole dan Pramono (1989) kadar kreatinin normal pada tikus adalah 0,2-0,8 mg/dL.

Tabel III adalah tabel klasifikasi Acute Kidney Injury atau gagal ginjal akut yang dibuat oleh Acute Kidney Injury Network (AKIN) pada tahun 2005 yaitu sebuah kolaborasi nefrolog dan intensivis internasional. Klasifikasi dibuat berdasarkan kenaikan kadar kreatinin (Cr) serum dan penurunan urine output (UO). Berdasarkan klasifikasi tersebut kenaikan kadar kreatinin serum ≥ 0,3 mg/dL sebagai ambang definisi dari AKI (AKI tahap I) karena dengan kenaikan tersebut telah didapatkan peningkatan angka kematian 4 kali lebih besar.

Penetapan batasan waktu terjadinya penurunan fungsi ginjal secara akut, disepakati selama maksimal 48 jam. (Nainggolan dan Robert, 2010)

Tabel III. Klasifikasi Acute Kidney Injury (AKI) berdasarkan AKIN pada tahun 2005 dengan kriteria Cr serum dan UO

(Nainggolan dan Robert, 2010). F. Karbon Tetraklorida (CCl4)

Karbon tetraklorida (CCl4) merupakan xenobiotik yang lazim digunakan

untuk menginduksi peroksidasi lipid dan keracunan. CCl4 dimetabolisme oleh

sitokrom P450 2E1 (CYP2E1) menjadi radikal bebas triklorometil (CCl3*).

Triklorometil dengan oksigen akan membentuk radikal triklorometilperoksi yang dapat menyerang lipid membran endoplasmik retikulum dengan kecepatan yang melebihi radikal bebas triklorometil. Selanjutnya, triklorometiloperoksi menyebabkan peroksidasi lipid sehingga mengganggu homeostasis Ca2+, dan akhirnya menyebabkan kematian sel (Panjaitan dkk., 2007).

Karbon tetraklorida menginduksi terjadinya stress oksidatif, hal ini memungkinkan karbon tetraklorida untuk digunakan sebagai nefrotoksin. Terpapar karbon tetraklorida dalam jumlah besar dapat mengakibatkan kerusakan hati, ginjal dan sistem saraf. Telah diketahui bahwa metabolisme karbon tetraklorida melibatkan produksi radikal bebas yang dihasilkan oleh enzim

pemetabolisme yang terdapat pada retikulum endoplasma (Moenim dan El-Khadragy, 2012).

Karbon tetraklorida merupakan nefrotoksin yang cukup kuat, yang menginduksi terjadinya stress oksidatif pada hewan uji di laboratorium. Mode aksi dari karbon tetraklorida adalah propagasi radikal triklorometil (CCl3),

peroksidasi lipid dari sistem membran dan penipisan status antioksidan serta kerusakan DNA pada ginjal tikus. Jaringan pada ginjal memiliki affinitas yang sangat baik terhadap karbon tetraklorida karena adanya keberadaan sitokrom P450 pada bagian korteksnya (Moenim dan El-Khadragy, 2012).

Senyawa hidrokarbon-halogen merupakan agen nefrotoksik. Contoh dari senyawa hidrokarbon halogen seperti trikloroetilen, karbon tetraklorida dan kloroform. Gagal ginjal akut yang disebabkan karena senyawa hidrokarbon-halogen dan glikol telah dilaporkan oleh (Nielsen dan Larsen, 1965).

G. Ekstraksi

Ekstrak merupakan sediaan kental yang diperoleh dengan cara mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian rupa hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2005).

Ekstraksi dengan metode maserasi merupakan cara penyarian sederhana yang dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari selama beberapa hari pada temperatur kamar dan terlindung dari cahaya sambil

diaduk (Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2010). Pada metode ini, cairan penyari akan masuk ke dalam sel melewati dinding sel sehingga isi sel akan larut akibat adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan di luar sel. Larutan dengan konsentrasi tinggi akan terdesak keluar dan diganti oleh cairan penyari dengan konsentrasi rendah (melalui proses difusi pasif). Peristiwa tersebut terjadi secara berulang hingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Selanjutnya, endapan dipisahkan dan filtrat dipekatkan (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia, 1986).

H. Landasan Teori

Ginjal adalah salah satu organ yang sangat berperan dalam sistem ekskresi. Ginjal menerima 25% darah dari curah jantung, sehingga sering kontak dengan zat kimia dalam jumlah besar (Stine and Brown, 1996). Pengecekan fungsi ginjal dapat dilaksanakan dengan pengukuran kreatinin (Saraswati, 2011).

Penemuan obat-obatan bahan alam untuk melindungi ginjal dari kerusakan atau gangguan fungsi dapat dilakukan dengan menggunakan hewan uji terinduksi karbontetraklorida. Hal ini karena karbon tetraklorida (CCl4)

merupakan xenobiotik dapat digunakan untuk menginduksi peroksidasi lipid dan keracunan (Panjaitan dkk, 2007). Biji Persea americana Mill. telah terbukti dapat memberikan efek antioksidan yang cukup baik karena di dalamnya terkandung berbagai macam senyawa fitokimia, diantaranya adalah saponin, tanin, flavonoid, sianogenik glikosida, alkaloid, fenol, steroid(Arukwe et al, 2012). Metanol telah terbukti dapat digunakan untuk mengekstrak senyawa fenolik total dalam biji

Persea americana Mill. dengan cukup baik (Carpena et al, 2011). Pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas ekstrak metanol biji Persea americana Mill. pada dosis efektif dalam menurunkan kadar kreatinin serum secara jangka pendek pada waktu pemberian 1, 4, 6 jam sebelum induksi CCl4 dengan data pendukung

berupa gambaran histologis ginjal.

I. Hipotesis

Ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. pada dosis 350 mg/kgBB memiliki khasiat nefroprotektif terhadap tikus putih jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida 2 mL/kgBB secara jangka pendek.

BAB III

METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah.

B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel utama

a. Variabel bebas. Variabel bebas dari penelitian ini adalah variasi waktu pemberian ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill., terhadap hewan uji tikus putih jantan galur Wistar.

b. Variabel tergantung. Variabel tergantung dari penelitian ini adalah efek nefroprotektif ekstrak metanol-air biji Perseae americana Mill., secara jangka pendek terhadap sel ginjal tikus jantan terinduksi karbon tetraklorida 2 mL/kgBB.

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali dari penelitian ini yaitu :

1. Hewan uji tikus jantan galur Wistar, berat badan 150-250 g, umur 2-3 bulan. 2. Cara pemberian ekstrak dilakukan secara per oral (p.o).

3. Bahan uji. Bahan uji yang digunakan berupa serbuk biji Perseae americana Mill. yang diperoleh dari Padang, Sumatra Barat yang telah dideterminasi dan ditetapkan kadar airnya di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

4. Cara pemberian karbon tetraklorida dilakukan secara intraperitonial dengan dosis 2 mL/kgBB.

5. Makanan dan minuman hewan uji penelitian. Makanan yang digunakan adalah pakan ternak BR II dan AD II serta air minum berupa air hasil reverse osmosis.

b. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau yang tidak dikendalikan berupa kondisi patologis hewan uji.

3. Definisi operasional

Definisi operasional yang digunakan pada penelitian ini, yaitu :

a. Variasi waktu pemberian. Variasi waktu pemberian adalah perbedaan waktu (selang waktu) pemberian ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dosis 350 mg/kgBB pada tikus putih jantan galur Wistar pada tiap kelompok perlakuan secara per oral (p.o) sebelum pemejanan karbon tetraklorida 2 mL/kgBB. Variasi waktu yang digunakan, yaitu 1, 4 dan 6 jam sebelum pemejanan karbon tetraklorida.

b. Efek nefroprotektif. Efek nefroprotektif adalah kemampuan ekstrak metanol biji Perseae americana Mill. pada dosis 350 mg/kgBB untuk melindungi ginjal dari nefrotoksin karbon tetraklorida secara jangka pendek (1, 4 dan 6 jam sebelum induksi CCl4.) yang ditandai dengan tolok ukur kuantitatif berupa kadar

C.Subyek dan Bahan Penelitian 1. Subyek penelitian

Subyek uji yang digunakan berupa tikus jantan galur Wistar, umur 2-3 bulan dengan berat badan berkisar antara 150-250 gram, diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Bahan penelitian

a. Bahan uji. Bahan uji adalah serbuk biji buah alpukat (Perseae americana Mill.). Bahan uji tersebut diperoleh dari Padang, Sumatera Barat yang telah diserbukkan, dideterminasi serta ditetapkan kadar airnya.

b. Bahan nefrotoksin. Bahan nefrotoksin adalah larutan karbon tetraklorida (CCl4) (E. Merck, Darmstadt, Germany) yang dilarutkan dalam Olive

Oil (merek dagang Bartoulli). Karbon tetraklorida diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Konsentrasi karbon tetraklorida yang digunakan adalah 50% dengan dosis 2 mL/kgBB.

c. Aquadest. Aquadest yang digunakan diperoleh dari Laboratorium Farmakologi Toksikologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

d. Bahan pengesktrak. Bahan pelarut yang digunakan untuk ekstraksi serbuk biji alpukat adalah metanol teknis (PT. Brataco) dengan konsentrasi 99% yang diencerkan hingga konsentrasi 70% menggunakan pengencer aquadest.

e. Kit pereaksi kreatinin. Penetapan kadar kreatinin digunakan pereaksi siap pakai kit kreatinin (E. Merck, Darmstadt, Germany) yang digunakan untuk

mengukur kadar kreatinin serum. Bahan terdiri atas dua reagen yaitu Reagen 1 dan Reagen 2 serta 1 serum standar.

f. Aquabidest. Aquabidest digunakan sebagai pencuci vitalab mikro dan juga sebagai blanko dalam pengukuran kadar kreatinin serum. Aquabidest ini diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

g. Bahan pembuat preaparat ginjal. Untuk pembuatan preparat sel ginjal digunakan formalin 10%, xilol, alkohol, lilin cetak, zat warna hematoksilin dan eosin (E. Merck, Darmstadt, Germany) yang diperoleh dari Balai Penyidikan dan Pengujian Veteriner (BPPV) Regional IV Wates-Yogyakarta.

h. Natrium-Carboxymethyl Cellulosa (CMC-Na). CMC-Na yang digunakan dalam bentuk serbuk, diperoleh dari Laboratorium Biofarmasetika Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

D. Alat dan Instrumen Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi :

1. Seperangkat alat gelas berupa gelas kimia, Erlenmeyer, gelas ukur, labu ukur, corong kaca, pipet tetes, pipet gondok, batang pengaduk, tabung reaksi (Pyrex, Iwaki Glass)

2. Mortar dan stamper 3. Cawan porselen 4. Timbangan analitik 5. Oven (Memmert) 6. Sentrifuge

7. Vortex

8. Spuit per oral dan syringe 3 mL 9. Pipa kapiler

10.Corong Buchner 11.Vakum

12.Tabung eppendrof

13.Vitalab micro (Microlab 200, Merck)\

E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi serbuk biji Persea americana Mill.

Determinasi serbuk biji Perseae americana Mill. dilakukan dengan mencocokan ciri-ciri serbuk biji Perseae americana Mill. dengan serbuk biji Persea americana Mill. yang telah dideterminasi dengan menggunakan buku acuan determinasi. Determinasi dilakukan secara makroskopis termasuk organoleptis serbuk dan secara mikroskopis. Determinasi dilakukan oleh Yohanes Dwiatamaka, M.Si yang merupakan Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Pengumpulan bahan

Bahan uji yang digunakan adalah biji Perseae americana Mill. yang telah diserbukkan dan diperoleh dari Padang, Sumatera Barat, Bulan Januari 2013.

3. Pembuatan serbuk

Biji Persea americana Mill. dicuci bersih dibawah air mengalir. Setelah bersih, biji kemudian dipotong-potong, disortir dan dikeringanginkan hingga biji tidak tampak basah lagi, kemudian biji Persea americana Mill. dikeringan di

dalam oven pada suhu 500 C selama 24 jam untuk mengoptimalkan proses pengeringan. Setelah kering, biji diserbukkan dan diayak dengan ayakan nomor 40. Pengayakan dilakukan agar kandungan fitokimia yang terkandung dalam biji Persea americana Mill. lebih mudah tersekstrak karena luas permukaan spesifik yang kontak dengan pelarut semakin besar.

4. Pembuatan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill.

Sebanyak 10 gram serbuk kering biji Persea americana Mill. diekstraksi dengan cara maserasi. Serbuk dilarutkan dalam 100 ml pelarut metanol 70% di dalam Erlenmeyer bersumbat kaca. Ekstraksi dilakukan pada suhu kamar. Perbandingan jumlah serbuk dan pelarut adalah 1:10. Campuran serbuk dan pelarut kemudian digojong selama 1 menit, didiamkan dalam ruangan gelap dan ditutup. Setiap harinya selama 5 hari berturut-turut pada jam yang sama dilakukan penggojogan selama 1 menit. Kemudian dilakukan penyaringan dengan kertas saring dengan bantuan pompa vakum. Ekstrak kemudian diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 70 0C hingga tidak ada lagi tetesan pada rotary evaporator. Hasilnya kemudian dipindahkan ke dalam cawan porselen yang telah ditimbang bobotnya terlebih dahulu. Selanjutnya, dipekatkan dengan menggunakan penangas air pada suhu 70 0C. dilakukan penimbangan setiap harinya hingga bobot ekstrak tetap (selisih bobot penimbangan dan bobot hasil penimbangan sebelumnya adalah sama). Kemudian ekstrak disimpan di dalam desikator hingga saat akan digunakan.

5. Penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill.

Penetapan kadar air dilakukan dengan menggunakan cara susut pengeringan. Sebanyak 5,0 g serbuk biji Persea americana Mill. ditimbang dan kemudian serbuk tersebut dimasukkan ke dalam alat moisture balance pada suhu 105 oC selama 15 menit dan kemudian dilakukan perhitungan kadar air berdasarkan selisih bobot sebelum dimasukkan ke dalam alat (sebelum pemanasan) dengan sesudah dimasukkan ke dalam alat moisture balance (sesudah pemanasan) selisih tersebut merupakan kadar air serbuk yang diteliti.

6. Pembuatan larutan Natrium-Carboxy Methyl Cellulosa (CMC-Na) 1 % Larutan CMC-Na 1% dibuat dengan cara menimbang 5,0 gram CMC-Na serbuk yang telah digerus dalam mortar dan stamper terlebih dahulu. Serbuk kemudian ditaburkan secara merata di permukaan 200 mL aquadest di dalam gelas kimia dan ditunggu hingga semua serbuk terbasahi, tanpa pengadukan. Setelah semua serbuk CMC-Na terbasahi maka dilakukan pengadukan hingga seluruh CMC-Na larut. Larutan CMC-Na kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 500 ml dan ditambahkan aquadest hingga batas tanda.

7. Pembuatan suspensi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dalam CMC-Na 1%

Suspensi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dibuat dengan konsentrasi 7% b/v. Pembuatan dilakukan dengan cara menimbang sebanyak 3,5 g ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. secara seksama. Ekstrak tersebut kemudian dilarutkan dengan menggunakan larutan CMC-Na 1% hingga seluruh ekstrak terlarut dengan baik. Suspensi ekstrak dipindahkan ke dalam labu takar 50

mL dan ditambah dengan larutan CMC-Na 1% hingga batas tanda, selanjutnya digojog hingga homogen.

8. Pembuatan larutan karbon tetraklorida (CCl4) konsentrasi 50%

Larutan CCl4 dalam Olive Oil dibuat dengan cara melarutkan 25 mL CCl4

dalam labu takar 50 mL kemudian ditambahkan dengan Olive Oil hingga tanda. Digojog hingga homogen. Pengambilan CCl4 dilakukan dengan menggunakan

pipet gondok 25 mL. 9. Uji pendahuluan

a. Penetapan waktu cuplikan darah. Untuk mendapatkan waktu pencuplikan darah dilakukan orientasi dengan 4 kelompok perlakuan waktu. Masing-masing kelompok menggunakan sejumlah 5 ekor tikus. Kelompok I diambil darah pada jam ke-0 atau sebelum dilakukan pemejanan karbon tetraklorida (CCl4), kelompok II diambil darah pada jam ke-24 setelah pemejanan

CCl4 2 mL/kgBB, kelompok III diambil darah pada jam ke-48 setelah pemejanan

CCl4 2 mL/kgBB dan kelompok IV diambil darah pada jam ke-72 setelah

pemejanan CCl4 2 mL/kgBB. Setelah pengambilan darah, darah diukur kadar

kreatinin serum dan ditentukan waktu optimal pengukuran cuplikan darah berdasarkan data kenaikan kreatinin serum.

b. Penetapan lama pemberian ekstrak metanol biji Persea americana Mill. Lama waktu pemberian ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill dilakukan selama 1, 4, 6 jam pada hari yang sama sebelum dipejankan senyawa nefrotoksin karbon tetraklorida 2 mL/kgBB dan diukur kadar kreatinin serum

pada waktu optimal pengukuran cuplikan darah, yaitu pada jam ke-48 setelah pemejanan karbon tetraklorida 2 mL/kgBB.

10.Pengelompokan dan perlakuan hewan uji

Sejumlah lima puluh dua ekor tikus dibagi secara acak ke dalam delapan kelompok perlakuan. Kelompok I (kontrol nefrotoksin) diberi larutan karbon tetraklorida 2 ml/KgBB secara intraperitonial. Kelompok II (kontrol negatif) diberi minyak zaitun (Olive Oil) dosis 2 mL/kgBB. Kelompok III (kontrol ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill.) dosis 350 mg/kgBB yang diberikan pada waktu 6 jam sebelum pemejanan karbon tetraklorida 2 mL/kgBB. Kelompok IV sampai dengan kelompok VIII berturut-turut diberi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dosis 350 mg/kgBB pada selang waktu 1, 4 dan 6 jam sebelum pemejanan karbon tetraklorida 2 mL/kgBB. Pemberian ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill diakukan secara oral. Kemudian setelah 1, 4 dan 6 jam pemberian ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dilakukan pemejanan karbon tetraklorida dosis 2 mL/kgBB secara intraperitonial.

Pengambilan darah dilakukan melalui sinus orbitalis mata pada waktu yang sama dengan waktu optimal pengukuran cuplikan darah, yaitu pada jam ke-48. Cuplikan darah kemudian diambil serumnya untuk diukur aktivitas kreatinin serum.

11. Pembuatan serum

Darah tikus diambil melalui sinus orbitalis mata dan ditampung dalam eppendrof 1,5 ml melalui dinding tabung, didiamkan selama 15 menit. Dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit dan diambil

supernatannya (serum), supernatan ditampung dalam eppendrof 1,5 mL. Serum yang belum diukur kemudian disimpan dalam lemari pembeku (Freezer).

12. Penetapan kadar kreatinin serum

Alat yang digunakan untuk menganalisis kadar kreatinin serum adalah vitalab mikro. Kadar kreatinin serum diukur pada panjang gelombang 340 nm, suhu 370 C dengan faktor koreksi -1745. Kadar kreatinin serum dinyatakan dalam mg/dL. Pengukuran kadar serum kreatinin dilakukan di Laboratorium Biokimia-Anatomi Manusia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Analisis dilakukan dengan cara sebagai berikut, sebanyak 50 μL serum dicampur dengan reagen I sebanyak 1000 µL, divortex selama 5 detik. Didiamkan selama 1 menit. Selanjutnya dilakukan penambahan reagen II sebanyak 250 μL, divortex 5 detik dan dibaca serapannya setelah didiamkan selama 2 menit.

13.Pembuatan formalin 10%

Formalin yang diperoleh memiliki konsentrasi 37%. Untuk memperoleh formalin dengan konsentrasi 10% maka dilakukan pengenceran formalin dengan cara mengambil sebanyak 270 mL formalin 37%, dimasukkan dalam labu takar 1 L dan ditambah dengan aquadest hingga batas tanda, digojog hingga homogen. 14.Pencuplikan organ ginjal tikus untuk pengamatan gambaran histologis

Tiga ekor hewan uji tikus jantan Wistar diambil secara acak untuk kemudian dikorbankan dengan menggunakan eter. Selanjutnya dilakukan nekropsi hewan uji tikus untuk kemudian diambil organ ginjalnya. Organ ginjal dicuci dengan larutan saline 0.9% dan disimpan dalam wadah bertutup yang telah diisi

dengan formalin 10% untuk selanjutnya dibuat preparat di Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

F. Tata Cara Analisis Hasil

Data yang diperoleh dalam penelitian diuji dengan Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui normalitas distribusi data dan Levene test untuk melihat homogenitas variansi antar kelompok data sebagai syarat analisis parametrik. Data selanjutnya dianalisis dengan analisis variansi pola searah (One Way ANOVA) dengan taraf kepercayaan 95% untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan bermakna antar kelompok. Kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe untuk melihat pada kelompok manakah terdapat perbedaan yang bermakna (signifikan) (p<0,05) atau tidak bermakna (p>0,05). Untuk kelompok kontrol negatif olive oil 2 mL/kgBB pengolahan data dilakukan dengan menggunakan uji t-berpasangan. Perhitungan % nefroprotektif terhadap nefrotoksin karbon tetraklorida diperoleh dengan rumus :

Keterangan :

36 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN A. Penyiapan Bahan

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui waktu efektif pemberian ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. pada tikus jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida dosis 2 mL/kgBB dengan melihat kadar kreatinin serum dan gambaran histologis ginjal. Tujuan tersebut dapat tercapai dengan serangkaian pengujian.

1. Hasil determinasi serbuk biji Persea americana Mill.

Determinasi serbuk biji Persea americana Mill. dilakukan dengan tujuan untuk memastikan bahwa serbuk biji yang digunakan adalah benar serbuk biji Persea americana Mill. Determinasi dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Determinasi dilakukan dengan cara mencocokkan kesamaan ciri serbuk biji yang digunakan dengan serbuk biji Persea americana Mill. yang telah dideterminasi sebelumnya. Hasil determinasi membuktikan bahwa benar serbuk biji yang digunakan dalam penelitian adalah serbuk biji Persea americana Mill. Hasil determinasi tertera dalam lampiran 4.

2. Penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill.

Penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill. bertujuan untuk mengetahui kadar air dalam serbuk dan untuk memastikan bahwa serbuk biji Persea americana Mill. yang digunakan dalam penelitian memenuhi salah persyaratan serbuk yang baik, yaitu mengandung kadar air kurang dari 10%

(Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995). Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Gravimetri dengan menggunakan alat moisture balance di Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Penetapan kadar air dilakukan dengan cara memanaskan serbuk di dalam alat pada suhu 105 0C selama 15 menit, setelah itu dilakukan perhitungan terhadap kadar air yang diteliti. Digunakan suhu 105 0C dengan maksud supaya kandungan air telah menguap (diatas titik didih air) dan waktu 15 menit dianggap bahwa kadar air dalam serbuk biji Persea americana telah memenuhi persyaratan parameter standarisasi simplisia. Hasil perhitungan menunjukkan bahwa serbuk biji Persea americana Mill. memiliki kadar air 7,4 %. Hal ini menyatakan bahwa serbuk biji Persea americana Mill. memenuhi persyaratan kadar air yang ditetapkan.

3. Hasil penimbangan bobot ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. Pembuatan ekstrak metanol-air daun biji Persea americana Mill. menggunakan metode penyarian, yaitu maserasi. Metode maserasi dipilih karena proses pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana serta tidak digunakan panas saat proses penyarian/ekstraksi sehingga mencegah kemungkinan rusaknya simplisia yang digunakan.

Cairan penyari yang digunakan adalah metanol-air (70 : 30) atau 70% karena metanol merupakan penyari yang digunakan untuk proses penyarian/ekstraksi total dimana hampir semua senyawa dapat terambil. Hal ini karena belum diketahuinya metabolit sekunder yang terdapat di dalam biji Perseae americana Mill. Pemilihan metanol 70% juga berdasarkan penelitian

yang menguji kemampuan ekstrak metanol-air (70 : 30) yang terbukti dapat bermanfaat sebagai antioksidan. Dengan kemampuannya sebagai antioksidan tersebut diduga ekstrak metanol-air (70 : 30) dari biji Persea americana Mill. juga memiliki kemampuan sebagai nefroprotektif sehingga dipilih penyari metanol-air (70 : 30) pada penelitian ini.

Parameter standarisasi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dilihat dari bobot pengeringan tetap. Tujuannya untuk menghitung sisa zat dengan bobot tetap setelah dilakukan pengeringan pada temperatur 70 0C – 75 0C. Pengeringan dilakukan dengan cara menimbang ekstrak dalam cawan porselen setiap satu jam hingga bobot konstan (pada penelitian ini selisih bobot penimbangan dengan penimbangan sebelumnya adalah 0). Dengan selisih bobot sebesar 0% dapat dipastikan pelarut penyari ekstrak (metanol) sudah tidak ada. Hasil menunjukkan bahwa sebanyak 10,0 g serbuk kering biji Persea americana Mill. menghasilkan kurang lebih 2,0 g ekstrak metanol-air. Keseluruhan pembuatan ekstrak metanol-air menggunakan 200,0 g serbuk kering biji Persea americana Mill. yang menghasilkan 53,1 g ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. Dengan rata-rata setiap cawan 2,78 g ekstrak kental dengan % rendemen sebesar 26,55 %.

B. Uji Pendahuluan 1. Penentuan dosis nefrotoksin karbon tetraklorida

Penelitian ini menggunakan karbon tetraklorida sebagai nefrotoksin. Penentuan dosis karbon tetraklorida ini bertujuan untuk mengetahui dosis karbon tetraklorida yang dapat menyebabkan kerusakan ginjal pada tikus yang

ditunjukkan dengan peningkatan kadar kreatinin serum yang berbeda bermakna dari kadar kreatinin serum tikus normal sebelum perlakuan pemberian karbon tetraklorida. Dosis yang dipilih untuk penelitian ini memberikan peningkatan kreatinin serum hingga 1,5 kali dibandingkan dengan sebelum diberi perlakuan. Penentuan dosis karbon tetraklorida berdasarkan hasil orientasi.

Dari data yang diperoleh menunjukkan bahwa karbon tetraklorida dosis 2 ml/kgBB dapat menaikkan kreatinin serum hingga 2,0 kali dari kondisi tanpa pemejanan karbon tetraklorida. Hal ini berdasarkan adanya kriteria yang

menyatakan bahwa dengan adanya peningkatan kreatinin serum menjadi ≥ 1,5

kali dari keadaan normal saja dapat menjadi indikasi terjadinya gagal ginjal akut (Nainggolan dan Robert, 2010).

2. Penentuan waktu pencuplikan darah

Penentuan waktu pencuplikan darah bertujuan untuk mengetahui waktu dimana karbon tetraklorida dosis 2 mL/kgBB dapat memberikan efek nefrotoksik optimal yang ditunjukkan dengan kadar kreatinin serum tertinggi dan berbeda bermakna dengan nilai kadar kreatinin serum pada jam ke-0 sebelum pemejanan karbon tetraklorida 2 mL/kgBB. Karbon tetraklorida dosis 2 mL/kgBB diujikan pada tikus dengan selang waktu pengambilan cuplikan darah, yaitu 0 jam sebelum pemejanan karbon tetraklorida, 24, 48 dan 72 jam setelah pemejanan karbon tetraklorida.

Data kenaikan kreatinin serum pada selang waktu 0 jam sebelum pemejanan karbon tetraklorida dan setelah pemejanan karbon tetraklorida dosis 2 mL/kgBB pada selang waktu 24, 48 dan 72 jam tersaji pada tabel IV serta gambar

Intratubular Hialin Cast (ITC)

Lampiran 15. Foto mikroskopik kelompok perlakuan ekstrak pemberian 6 jam sebelum pemejanan karbon tetraklorida 2 ml/kgBB

Lampiran 16. Perhitungan % nefroprotektif Rumus perhitungan efek nefroprotektif

Keterangan :

KKS = Kadar kreatinin serum

Maka perhitungan efek nefroprotektif adalah sebagai berikut :

 Kelompok perlakuan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill 350 mg/kgBB 1 jam sebelum pemejanan CCl4 2 mL/kgBB

 Kelompok perlakuan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill 350 mg/kgBB 4 jam sebelum pemejanan CCl4 2 mL/kgBB

 Kelompok perlakuan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. 350 mg/kgBB 6 jam sebelum pemejanan CCl4 2 mL/kgBB

Lampiran 17. Perhitungan konversi dosis untuk manusia

 Angka konversi Tikus 200 g ke Manusia 70 kg = 56,0

 Dosis untuk manusia = Dosis untuk tikus 200 g x (angka konversi ke manusia)

= ( 350 mg/kgBB x 0,2 kg ) x 56,0 = 3920 mg/70kg

= 3,92 g/70kg

Lampiran 18. Perhitungan konversi hari untuk manusia

 1 Bulan untuk tikus = 34 bulan untuk manusia Maka 1 hari untuk tikus = 34 hari untuk manusia 1 jam untuk tiikus = 34 jam untuk manusia

4 jam untuk tikus = 136 jam untuk manusia 6 jam untuk tikus = 204 jam untuk manusia

Penetapan kadar air dilakukan menggunakan alat moisture balance dengan metode Gravimetri. Pemanasan serbuk biji Persea americana Mill. dilakukan pada suhu 105 0C selama 15 menit.

Tabel IX. Hasil penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill. Bobot Replikasi I Replikasi II Replikasi III Sebelum

pemanasan

5,000 g 5,000 g 5,000 g

Sesudah pemanasan

4,624 g 4,636 g 4,630 g

Kadar air 7,52 % 7,28 % 7,40%

Rata-rata kadar air 7,40 %

Kadar air =

Replikasi 1 =

7,52 %

Replikasi 2 =

7,28 %

Replikasi 3 =

7,40 %

Lampiran 20. Hasil rendemen ekstrak metanol-air daun M. tanarius

Tabel X. Hasil rendemen ekstrak metanol-air Biji Persea americana Mill. Keterangan (gram) Cawan

1

Cawan 2

Cawan 3

Cawan 4

Cawan 5

Cawan kosong 63,29 66,22 47,06 53,57 50,5 Cawan + ekstrak 66,18 69,09 49,93 56,31 53,03

Rendemen 2,89 2,87 2,87 2,74 2,53

% Rendemen ekstrak kental =

x 100% = 26,55%

Jumlah serbuk yang digunakan untuk pembuatan ekstrak kental sebanyak 200 g serbuk kering biji Persea americana Mill., pada tiap cawannya digunakan 10 g serbuk kering dalam 100 mL pelarut metanol-air 70%. Rata-rata rendemen setiap 10 g serbuk kering adalah sebesar 2,78 gram ekstrak kental. Pada pembuatan 200 g serbuk kering biji Persea americana Mill. menghasilkan 53,1 g ekstrak kental, dengan % rendemen 26,55 %.

Lampiran 21. Bobot pengeringan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill.

Tabel XI. Bobot pengeringan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. Cawan Berat cawan

kosong (gram)

Jam ke 0 08.00 1 09.00 2 10.00 3 11.00 4 12.00 5 13.00 1 63,29 Berat

ekstrak (g)

101,00 82,11 70,09 66,42 66,18 66,18 2 66,22 97,61 85,90 75,30 70,03 69,09 69,09 3 47,06 80,52 70,65 57,23 50,11 49,93 49,93

Lampiran 22. Hasil pengukuran validitas dan reabilitas Tabel XIX. Hasil validitas dan reabilitas dilihat dari serum kontrol

(range 1,09 - 1,71 mg/dL)

x ( mg/dL )

x -

(x - )2

1,7

1,68

0,02 0,0004

1,7 0,02 0,0004

1,7 0,02 0,0004

1,7 0,02 0,0004

1,6 -0,08 0,0064

∑ 0,008

SD =

√

∑ ̄

SD =

√

=

0,04 Range x SD 1, 0,0 = 1,64 – 1,72

CV =

x 100%

=

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “Efek Nefroprotektif Jangka Pendek Ekstrak Metanol-Air Biji Persea Americana Mill. Terhadap Kadar Kreatinin Dan Gambaran Histologis Ginjal Tikus Jantan Wistar Terinduksi Karbon Tetraklorida” memiliki nama lengkap Liana Risha Gunawan. Penulis lahir di Surakarta pada tanggal 14 November 1992, merupakan putri kedua dari dua bersaudara dalam keluarga pasangan Elsye Susana dan Arianto Gunawan. Penulis mengawali masa pendidikannya di TK Tunas Rimba I Randublatung, Blora (1995-1998), kemudian melanjutkan pendidikan tingkat Sekolah Dasar di SD Negeri Wulung 2 Randublatung, Blora (1998-2004). Pendidikan Sekolah Menengah Pertama ditempuh oleh penulis di SMP Negeri 1 Randublatung, Blora (2004-2007). Pendidikan Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri 1 Randublatung (2007-2010). Penulis kemudian melanjutkan pendidikan sarjana di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2010. Semasa menempuh kuliah, penulis pernah menjadi anggota sie dana dan usaha donor darah (2010), menjadi sekretaris Kampanye Informasi Obat (2011), volunteer Hari Anti Tembakau (2011), anggota kesekretariatan seminar nasional dan longmarch dalam rangka memperingati hari HIV/AIDS dunia (2012), anggota divisi Quality Control di Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma (2012) dan penulis pernah menjadi asisten praktikum Farmakologi-Toksikologi (2013).