Definisi dan Instrumentasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
pencampuran fase gerak tersebut dialirkan ke dalam kolom Snyder, Kirkland and Dolan, 2010.
Pemilihan fase gerak dalam suatu metode pemisahan berdasarkan pada indeks polaritas P’ campuran fase gerak tersebut.Semakin besar nilai indeks
polaritasnya menyatakan semakin polar fase gerak yang digunakan.Fase gerak yang sering digunakan merupakan kombinasi dari dua atau lebih campuran pelarut
yang saling bercampur secara keseluruhan. Campuran fase gerak tersebut akan menghasilkan nilai polaritas tersendiri yang disebut indeks polaritas fase gerak
Harvey, 2000. ′
=
Φ
.
′
+
Φ
.
′
2
Keterangan, Φ
A
dan Φ
B
= fraksi volume pelarut pada pelarut A dan B P’
A
dan P’
B
= indeks polaritas pelarut pada pelarut A dan B Harvey, 2000.
Tabel I. Indeks polaritas dan karakteristik solvent selectivity beberapa pelarut KCKT
Snyder, Kirkland dan Dolan, 2010
Deret eluotropik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan panduan yang berguna dalam pemilihan fase gerak yang akan digunakan dalam
KCKT. Deret eluotropik dapat dilihat pada tabel I. b.
Pompa Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang
mempunyai syarat sesuai dengan syarat wadah pelarut yaitu pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang sering digunakan untuk pompa yakni gelas, baja
tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan alir 3mLmenit Rohman, 2009. Penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah agar dapat menjamin proses penghantaran fase
gerak yang berlangsung dengan tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas gangguan Gandjar dan Rohman, 2010.
Selain itu, pompa yang digunakan juga harus dapat menjamin akurasi dan konsistensi kecepatan alir dari fase gerak yang dibutuhkan untuk menjaga
stabilitas dan ripitabilitas interaksi antara zat analit dengan fase diam. Kecepatan alir yang buruk dapat mempengaruhi waktu retensi dan resolusi pemisahan analit
Chan et al., 2004. c.
Tempat penyuntikan sampel Penyuntikan sampel pada KCKT dilakukan secara langsung ke dalam fase
gerak yang mengalir menuju kolom. Penggunaan syringe atau autosampler merupakan wadah yang digunakan dalam penyuntikan sampel Gandjar dan
Rohman, 2010. Pada sistem KCKT, penyuntikan sampel melalui loop
injectoryang dapat menyimpan volume dari 0,5 L – 2 mL. Pada posisi load,
sampel diinjeksikan dan loop sampler terisolasi dari fase gerak. Kemudian ketika katup dipindahkan ke posisi loading posisi inject, injectorakan berpindah ke
posisi inject dan saat itu fase gerak mengaliri sampel dan terbawa memasuki kolom Harvey, 2000.
Gambar 3.Skema sampler KCKT. a posisi load, sampel diinjeksikan dan terisolasi dari fase gerak. b posisi inject, sampel terbawa fase gerak dan memasuki kolom Denney, 1993
d. Kolom
Kolom merupakan bagian terpenting dalam rangkaian KCKT karena fase diam dalam KCKT terdapat dalam kolom.Dengan demikian, pemisahan analit dari
komponen lainnya terjadi pada kolom.Keberhasilan pemisahan analit tergantung pada keadaan kolom, sehingga pemilihan kolom sangatlah penting Mulja dan
Suharman, 1995. Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi atau
polimer-polimer stiren dan divinil benzene.Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol Si-OH. Modifikasi silika secara
kimia akan menutupi gugus silanol dan menggantinya dengan guus fungsional
lain. Hasil reaksi kimiawi tersebut akan menghasilkan silika yang stabil terhadap hidrolisis karena terbentuk ikatan siloksan Si-O-Si. Hasil modifikasi tersebut
memiliki karakter kromatografi dan selektivitas yang berbeda dengan gugus silanol bebas Gandjar dan Rohman, 2010. Oktadesilsilan ODS atau C
18
merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, dan tinggi.
e. Detektor
Terdapat dua golongan detektor pada KCKT yaitu detektor umum dan spesifik.Detektor umum merupakan detektor yang dapat mendeteksi zat secara
umum, tidak bersifat selektif dan spesifik. Contoh dari detektor umum adalah detektor indeks dan detektor massa. Detektor spesifik merupakan detektor yang
hanya dapat mendeteksi suatu analit sesuai dengan spesifikasi tertentu, misalnya detektor UV-Vis, detektor fluoresensi dan elektrokimia.Penggunaan detektor
spesifik, maka analit yang digunakan harus memiliki persyaratan yang sesuai untuk dapat dideteksi dengan detektor tersebut Rohman, 2009.
Detektor Spektrofotometri UV-Vis Detektor UV-Vis merupakan detektor yang paling banyak digunakan
karena hampir semua senyawa obat memiliki struktur yang dapat menyerap sinar UV-Vis. Sel detektor umumnya berupa tabung berdiameter 1 mm dan panjang
celah optik 10 mm Gandjar dan Rohman, 2007. Senyawa yang dapat dideteksi dengan detektor UV-Vis ini adalah senyawa yang memiliki gugus kromofor dan
auksokrom serta memiliki serapan pada panjang gelombang UV dan Vis.
Menurut Gandjar dan Rohman 2010, detektor pada KCKT memiliki beberapa karakteristik sebagai berikut :
a. Respon terhadap analit cepat dan reprodusibel
b. Mampu mendeteksi analit hingga kadar yang sangat kecil
c. Stabil saat dioperasikan
d. Memiliki sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran
pita e.
Sinyal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi analit pada kisaran luas AUC
f. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak