15
BAB III METODE PENELITIAN
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan menguji efek toksisitas dari ekstrak etanol, fraksi n-heksana, fraksi etilasetat dan fraksi air daun
titanus Leea aequata L. terhadap Artemia salina Leachmenggunakan metode Brine
Shrimp Lethality
Test
yang
dilakukan di
Laboratorium FarmakognosiFakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara.
3.1 Alat
Alat –alat yang digunakandalampenelitianiniadalah alat-alat gelas
laboratorium, aluminium foil,bejanamaserasi, bejana penetasan telur Artemia salina Leach, blender Panasonic, Jerman, bola karet, cawan porselin, desikator,
inkubator, krus porselin, kaca objek, kaca penutup, kertassaring, kertas label, batang pengaduk, lampu pijar 5 watt Hannochs, China,lemari pengering,
mikroskop Boeco, Jerman,mortirdanstamfer, neraca analitik Vibra AJ, Jepang,penangas air Stuart, Inggris, evaporator berputarStuart, Inggris,
seperangkatalatdestilasi, spatula, statif,seperangkat alat penetapan kadar air Stuart, Inggrisdanvial 10 ml.
3.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun titanus, telur Artemia salina Leach, air laut buatan ALB, ragi, garam non-yodium, Na-CMC
Natrium-Carboxy Methyl Cellulose dan akuades.Bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas pro analisis yaitu
: α-naftol,amonium hidroksida, asam asetat anhidrida, asam sulfat 2N, asam asetat pekat, asam klorida
Universitas Sumatera Utara
16
2 N, asam klorida pekat, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, asam nitrat 0,5 N, benzena, besi III klorida, bismuth III nitrat, etanol destilasi, etilasetat
destilasi,n-heksana destilasi, eter,isopropanol, kalium iodida, kloroform, metanol, natrium hidroksida, amil alkohol, natrium sulfat anhidrat, petrolum eter,
raksa II klorida, serbuk magnesium, serbuk zinkum, timbal II asetat dan toluena.
3.1 Pembuatan Pereaksi
3.3.1 Pereaksi Kloralhidrat
Sebanyak 50 g kloralhidrat dilarutkan dalam 20 mLl air suling Depkes, RI., 1979.
3.3.2 Pereaksi Dragendroff
Sebanyak 8 g bismut III nitrat dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat pekat. Pada wadah lain dilarutkan 27,2 g kalium iodida dalam 50 ml air suling,
kemudian kedua larutan dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna. Diambil lapisan jernih dan diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Depkes,
RI., 1980.
3.3.3 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida dilarutkan dalam air suling secukupnya, ditambahkan 2 g iodium dicukupkan dengan air suling hingga 100 mL Depkes,
RI., 1978.
3.3.4Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8,002 g kristal natrium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Depkes RI, 1978.
3.3.5 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Universitas Sumatera Utara
17
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat dilarutkan dalam air suling bebas CO
2
hingga 100 mlDepkes, RI., 1978.
3.3.6 Pereaksi besi III klorida 1 bv
Sebanyak 1 g FeCl
3
dilarutkan dalam air 100 ml Depkes, RI., 1978.
3.3.7 Pereaksi asam nitrat 0,5 N
Sebanyak 3,4 ml asam nitrat pekat diencerkan dengan air suling 100 mL Depkes, RI., 1979.
3.3.8 Pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 17 ml HCl pekat diencerkan dalam air suling 100 ml Depkes RI, 1978.
3.3.9 Pereaksi asam sulfat 2 N
Sebanyak 9,8 ml H
2
SO
4
pekat ditambahkan air suling 100 ml Depkes, RI., 1978.
3.3.10 Pereaksi Lieberman-Burchard
Sebanyak 5 ml asam asetat anhidrat dicampurkan perlahan dengan 5 ml H
2
SO
4
pekat, ditambahkan 50 ml etanol ke dalam campuran tersebut wagner, 1984.
3.3.11 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,3596 g raksa II klorida ditimbang, dilarutkan dalam air suling 60 ml. Wadah lain ditimbang 5 g kalium iodida, dilarutkan dalam 10 ml air
suling, dicampurkan dan ditambahkan air suling 100 ml Depkes RI, 1980.
3.3.12 Pereaksi Molisch
Sebanyak 3 g α-naftol ditimbang, kemudian dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga 100 ml Depkes, RI., 1978.
3.4 Penyiapan Sampel
Universitas Sumatera Utara
18
Penyiapan sampel meliputi pengambilan sampel, identifikasi sampel serta pengolahan sampel Malinda, 2015.
3.4.1Pengambilan sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purfosif tanpa membandingkan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Sampel yang digunakan adalah daun titanus
segar yang berwarna hijau tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda yang diambil dari Desa Suka Nalu, Kecamatan Barus Jahe, Kabupaten Karo, Provinsi Sumatera
Utara.
3.4.2Identifikasi sampel
Identifikasisampeldilakukandi HerbariumBogoriense,
Bidang BotaniPusatPenelitianBiologiLembagaIlmuPengetahuan Indonesia LIPI Bogor.
3.4.3 Pengolahan sampel
Sebanyak 4 kg daun titanus dibersihkan dari pengotor dengan cara mencuci dibawah kran air yang mengalir hingga bersih, ditiriskan, ditimbang,
dikeringkan dengan rak pengering selama 5 hari, disortasi kering, ditimbang berat kering. Sampel dianggap kering apabila sudah rapuh bila diremas, kemudian
diserbukkan, disimpan dalam wadah plastik dan ditimbang Malinda, 2015.Bagan pengolahan sampel dapatdilihatpada Lampiran 7, halaman 49.
3.5 Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah telur udang Artemia salina Leach kering yang diproduksi oleh Amerika Serikat yang
diperoleh dari salah satu toko penjual ikan hias di dekat Plaza Thamrin. Jalan Mohammad Husni Thamrin No. 73B Medan.
3.6 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Universitas Sumatera Utara
19
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik dan penetapan kadar air.
3.6.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk luar, ukuran, bau, rasa serta warna dari simplisiaDepkes, RI., 2007.
3.6.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia daun titanus. Sejumlah serbuk simplisia ditaburkan diatas objek glass yang telah ditetesi dengan
larutan kloralhidrat, ditutupi dengan kaca penutup kemudian diamati dibawah mikroskop Depkes, RI., 2007.
3.6.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluena. Cara kerja: Dimasukkan 200 ml toluena dan 2 mL air suling ke dalam labu alas bulat,
lalu didestilisasi selama 2 jam. Toluena dibiarkan mendingin selama 30 menit, dan dibaca volume air pada tabung penerima dengan ketelitian 0,05 ml.
Dimasukkan 5 g serbuk simplisia ke dalam labu tersebut yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Toluena mendidih, kecepatan
tetesan diatur lebih kurang 2 tetes perdetik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan tetesan destilasi dinaikkan hingga 4 tetes perdetik. Semua air
terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin sampai suhu
kamar. Air dan toluena memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air dibaca sesuai dengan kandungan air yang
terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam WHO, 1998.
3.7 Skirining Fitokimia
Universitas Sumatera Utara
20
Skrining fitokimia fraksi n-heksana, etilasetat dan air dilakukan dengan cara yang sama dengan skrining fitokimia serbuk simplisiaekstrak etanol sebanyak 0,1
g tiap-tiap fraksi meliputi pemeriksaan golongan alkaloid, flavonoid, glikosida, glikosida antrakinon, saponin, tanin dan steroidtriterpenoid.
3.7.1 Pemeriksaan alkaloid
Sebanyak 0,1 g fraksi n-heksana ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan
disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk uji alkaloid sebagai berikut: a.
Filtrat 3 tetes ditambah 2 tetes pereaksi Mayer, maka akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau putih kekuningan.
b. Filtrat 3 tetes ditambah 2 tetes peraksi Bouchardat, maka terbentuk endapan
berwarna coklat sampai hitam. c.
Filtrat 3 tetes ditambah 2 tetes peraksi Dragendorff, maka akan terbentuk endapan warna merah atau jingga.
Alkaloida positif jika ada endapan atau keruhan paling sedikit dua dari 3 percobaan diatas Depkes, RI., 1995.
3.7.2 Pemeriksaan glikosida
Sebanyak 0,1 g fraksi n-heksana disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air 7:3 dan 10 ml asam sulfat 2 N, direfluks selama 10 menit,
didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat, ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, dididamkanselama 5 menit lalu disaring.
Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan sebanyak 3 kali menghasilkan 2 lapisan. Dikumpulkan masing-masing sari sari
air dan sari pelarut organik. Sari pelarut organik dikumpulkan dan ditambahkan natrium sulfat anhidrat, disaring kemudian diuapkan pada suhu tidak lebih dari
Universitas Sumatera Utara
21
50
o
C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sari air digunakan untuk percobaan berikut: 0,1 ml larutan percobaan dimasukkan dalam tabung reaksi,
diuapkan di atas penangas air. Pada larutan ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molisch, lalu ditambahkan dengan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat
melalui dinding tabung, terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan, menunjukkan adanya ikatan gula glikon Depkes, RI., 1995.
3.7.3 Pemeriksaan glikosida antrakinon
Sebanyak 0,1 g fraksi n-heksana ditambahkan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzena, dikocok dan
didiamkan. Lapisan benzen dipisahkan dan disaring. Filtrat berwarna kuning menunjukkan adanya antrakinon. Kocok lapisan benzena dengan 2 ml NaOH 2 N,
lalu didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan benzena tidak berwarna menunjukkan adanya senyawa antrakinon Depkes RI, 1995.
3.7.4 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,1 g fraksi n-heksana dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10
detik. Terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin
Depkes, RI., 1995.
3.7.5 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,1 g fraksi n-heksana disari dengan 10 ml dalam air suling lalu disaring. Filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil
sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika
terjadi warna biru atau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth, 1966. 3.7.6 Pemeriksaan steroidtriterpenoid
Universitas Sumatera Utara
22
Sebanyak 0,1 g fraksi n-heksana dimaserasi dengan 20 ml n-heksana selama 2 jam lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Sisa
ditambahkan 2 tetes pereaksi Liebermann-Burchard, diteteskan pada saat akan mereaksikan sampel uji melalui dinding cawan. Timbulnya warna biru atau biru
hijau menunjukkan adanya steroid, sedangkaan warna merah, merah muda atau ungu menunnjukkan adanya triterpenoid Harbone, 1987.
3.7.7 Pemeriksaan flavonoida
Sebanyak 0,1 g fraksi n-heksana ditambahkan 10 ml air panas, didihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Filtrat yang diperoleh diambil
5 ml, ditambahkan 0,1 g sebuk magnesium, 1 ml asam klorida pekat, 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna
merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.
3.8 Pembuatan Ekstrak dan Fraksinasi 3.8.1 Pembuatan ekstrak etanol
Pembuatanekstrak etanol dilakukan secara maserasi dengan perbandingan serbuk simplisia dan cairan penyari adalah 1:10 yaitu sebanyak 500 g serbuk simplisisa
dimasukkan kedalam wadah gelas berwarna gelap, dituangi 75 bagian cairan penyari etanol 96, ditutup, dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya
sambil sering diaduk. Disaring dan dicuci ampas dengan cairan penyari secukupnya hingga diperoleh 100 bagian. Pindahkan kedalam bejana tertutup,
biarkan ditempat sejuk dan terlindung dari cahaya selama 2 hari, dienaptuangkan atau saring. Maserat diuapkan menggunakan evaporator berputar pada suhu 40
C sampai diperoleh ekstrak kental, kemudian dikeringkan Ditjen POM, 1979.
3.8.2 Pembuatan fraksi
Universitas Sumatera Utara
23
Fraksinasi dilakukan dengan metode ekstraksi cair-cair ECC. 10 g ekstrak kental daun titanus dilarutkan dalam 10 ml etanol, ditambahkan 50 ml air suling,
kemudian ditambahkan dengan n-heksana sebanyak 50 ml menggunakan corong pisah, digojok dan biarkan sampai memisah, kemudian dipisahkan, selanjutnya di
fraksinasi kembali dengan menggunakan pelarut n-heksana hingga diperoleh fraksi yang jernih tidak memberikan hasil positif dengan penambahan pereaksi
Liebermann-Buchard, kemudian fraksi air ditambahkan 50 ml etilasetat, di gojok dan dibiarkan memisah. Lapisan etilasetat dipisahkan dan fraksinasi dilanjutkan
sampai diperoleh fraksi etilasetat yang jernih tidak memberikan hasil positif dengan penambahan pereaksi FeCl
3
1. Kumpulan hasil fraksi n-heksana, fraksi etilasetat dan fraksi air masing-masing diuapkan dengan evaporator berputar pada
temperatur 40 C sampai diperoleh ekstrak kental, kemudian dikeringkan dan
disimpan pada tempat yang sesuai Amelia, 2015. Bagan pembuatan fraksi dapat dilihat pada Lampiran 7, halaman 50.
3.9 Perhitungan Rendemen
Perhitungan rendemen dilakukan dengan menghitung jumlah ekstrak yang diperolehdengan simplisia awal kemudian dikalikan 100 Ditjen, POM., 2000.
3.10 Uji Toksisitas
Kategori