9. Pengelompokkan dan prosedur pelaksanaan toksisitas subakut
Lima puluh ekor tikus dibagi secara acak menjadi 5 kelompok, tiap kelompok terdapat 5 ekor tikus jantan dan 5 ekor tikus betina. Kelompok I
sampai kelompok IV diberi perlakuan infusa biji P. americana Mill. dengan peringkat dosis berturut-turut yaitu 202,24; 360; 640,8 dan 1140,6 mgkg BB.
Kelompok V adalah kelompok kontrol negatif yang diberi aquadest dengan dosis 1142,86 mgkg BB.
Uji toksisitas subakut dilakukan dengan cara pemberian infusa biji P. americana
Mill. satu kali sehari selama 28 hari pada hewan uji sesuai dosis pemberian di mana tikus tetap diberi makan dan minum. Pada hari ke-1,
semua tikus yang sudah dipuasakan selama 5 jam diambil darahnya melalui sinus orbital mata dan ditampung pada eppendorf, lalu dilakukan pengukuran
kadar glukosa dalam darah di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu UGM, Yogyakarta. Pada hari ke-29, dibuat perlakuan yang sama
seperti hari pertama. Setelah itu dilanjutkan dengan pembedahan pada sebagian dari jumlah hewan uji dan dilihat histopatologis pankreas. Hewan
uji yang tersisa dipelihara selama 14 hari tanpa diberi perlakuan infusa biji P. americana
Mill. untuk melihat sifat efek toksik terbalikkan reversible atau tak terbalikkan irreversible. Pada hari ke-15 dilakukan pembedahan
terhadap hewan uji.
10. Prosedur pemusnahan hewan percobaan
Sebelum pembedahan, hewan uji dikorbankan dengan cara anestetika overdose, yakni memasukkan tikus ke dalam wadah tertutup berisi
eter yang akan diinhalasi oleh tikus. Setelah dibedah caesar dengan membuat irisan di garis tengah ventral tubuh, kemudian diambil organ yang diinginkan,
yaitu pankreas dengan menggunakan pinset dan gunting bedah. Pankreas dicuci bersih dengn NaCl 0,9 kemudan difiksasi dan dimasukkan ke dalam
wadah berisi formalin 10 untuk diawetkan. Hewan uji yang sudah diambil organnya, dimasukkan ke dalam kantong plastik dan dibungkus lagi dengan
kertas, diletakkan di dalam tas plastik, ditutup dan dikubur di halaman laboratorium.
11. Pembuatan preparat histopatologis
Organ yang disimpan dalam wadah berisi formalin 10 dilakukan trimming,
yaitu pemotongan tipis jaringan setebal kurang lebih 4 mm dengan orientasai sesuai dengan organ yang akan dipotong. Potongan jaringan
dimasukkan dalam embedding cassette dan dilanjutkan dengan dehidrasi menggunakan tissue processor untuk mengeluarkan air yang terkandung
dalam jaringan. Dehidrasi menggunakan cairan dehidran, seperti etanol atau isopropil alkohol. Cairan dehidran kemudian dibersihkan dari dalam jaringan
dengan menggunakan reagen pembersih, yaitu xilol selama 1 jam, yang kemudian diganti dengan parafin dengan metode penetrasi ke dalam jaringan
selama 2 jam. Setelah melalui proses dehidrasi, maka jaringan yang berada dalam embedding cassette dipindahkan ke dalam base mold yang diisi dengan
parafin cair. Jaringan kemudian dipotong dengan menggunakan mikrotom, lalu dilakukan pewarnaan. Karena preparat yang diinginkan untuk
pemeriksaan rutin, dipergunakan teknik pewarnaan Harris hematoksilin-
eosin. Setelah jaringan pada preparat diwarnai, kaca preparat ditutup dengan coverglass
Carson, 1990.
12. Pengamatan uji toksisitas subakut
a. Penimbangan berat badan hewan uji Purata perubahan berat badan tiap kelompok hewan uji
dihitung pada hari ke-0, 7, 14, 21 dan 28. Data dianalisis secara statistik General Linier Model
metode multivariate. b. Pengukuran asupan pakan hewan uji
Asupan pakan hewan uji berupa 30 g pelet AD-2 yang diberikan setiap hari. Cara mengukur besarnya asupan makan tikus
yaitu dengan menimbang pakan yang diberikan pada hari pertama dan pakan yang masih tertinggal di wadah pada hari kedua. Selisih
penimbangan antara berat pakan hari pertama dengan berat pakan hari kedua, dihitung sebagai asupan makanan yang dihabiskan pada hari
pertama. c. Pengukuran asupan minum hewan uji
Asupan minum berupa 100 ml air reverse osmosis RO yang diberikan setiap hari. Minuman diberikan dalam wadah botol berskala
dengan pipa yang diberi lubang pada ujungnya. Air minum yang dihabiskan tikus pada hari pertama dihitung dengan cara mengurangkan
jumlah air minum yang diberikan pada hari pertama dengan jumlah air minum sisa pada hari kedua. Selisih pengukuran antara volume minum
hari pertama dengan volume minum hari kedua dihitung sebagai asupan minum yang dihabiskan pada hari pertama.
F. Tata Cara Analisis Hasil 1.
Kategori